益生菌制剂加工技术的研究概况

胡珊，胡事君，吴清平，罗华建，梁卫驱，罗诗，陈仕丽

（1.东莞市农业科学研究中心，广东 东莞 523086；2.广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070）

益生菌制剂加工技术的研究概况

胡珊1，胡事君1，吴清平2，罗华建1，梁卫驱1，罗诗1，陈仕丽1

（1.东莞市农业科学研究中心，广东 东莞 523086；2.广东省微生物研究所 广东省菌种保藏与应用重点实验室，广州 510070）

对目前益生菌制剂的加工技术，包括：喷雾干燥技术、冷冻干燥技术、包埋技术的研究概况进行了综述。喷雾干燥技术中优化工艺参数、热应激蛋白、细胞损伤位置和机理研究，提高益生菌制品的质量；冷冻干燥技术中保护剂、冷应激蛋白对益生菌保护作用研究；包埋技术中重点介绍了微胶囊包埋技术的包囊材料、包埋方法的研究对益生菌制剂的改良。

益生菌制品；喷雾干燥；冷冻干燥；微胶囊包埋

0 引 言

近年来，随着经济的高速发展，人们对身体健康的关注度日趋升高。益生菌具有包括改善消化系统功能、增强免疫、降低血脂血压、抑制有害微生物、恢复肝功能、甚至抗恶性肿瘤等多种益生功能，其制剂倍受青睐。益生菌制剂中益生菌要能耐胃酸胆汁，活菌到达肠道并定于肠黏膜上才能对人体产生有益作用。为了保障益生菌制剂的保健作用，学者对喷雾干燥、冷冻干燥和包埋等益生菌制剂的的加工技术进行了大量研究。本文将益生菌制剂加工技术的研究概况进行归纳分析，以期为进一步研究提供参考。

1 喷雾干燥技术

喷雾干燥是食品工业应用悠久、广泛，是成本极为廉价的一种固定化方法，方法是以单一工序将溶液、乳液、悬浮液或浆状物加工成粉状干燥制品。将被干燥的液体经雾化器作用，喷成非常细微的雾滴，并依靠干燥介质（热空气、冷空气、烟道气或惰性气体）与雾滴均匀混合，进行热交换和质交换，使得溶剂气化或使得熔融物固化。

对喷雾干燥法造成的细胞损伤位置和机理的研究，有助于优化喷雾干燥技术在益生菌制剂生产中的应用[3]。喷雾干燥过程中细胞损伤主要由于是高温和干燥脱水。细胞失水可能引起细胞膜、蛋白质结构和功能完整性的不可逆变化，这些基本的功能和结构对于细胞存活和保持功能性至关重要。喷雾干燥温度对微生物的致死作用主要是由于蛋白质、核酸与酶系统等重要生物高分子的氢键受到破坏，导致菌体蛋白质凝固变性，核酸发生降解变性失活，从而破坏细胞的组成；热溶解细胞膜上类脂质成分形成极小的孔，使细胞内容物泄漏，从而导致死亡。在喷雾干燥对保加利亚乳杆菌细胞膜的影响研究中发现，喷雾干燥后受损伤细胞内一些细胞质（蛋白质、核酸、钾离子）部分流失。

近年来，喷雾干燥技术研究主要聚焦在工艺参数的优化，如适合培养基的选择，不同保护剂的添加，不同出口温度的存活率等。Ananta[2]等人评价了以脱脂乳为保护剂的益生菌Lactobacillus rhamnosusGG （标准株53103）喷雾干燥的可应用性。在不同出口温度（70～100℃）条件下进行喷雾干燥，当出口温度为80℃时，以脱脂乳为载体喷雾获得60%的存活率。共聚焦扫描激光显微镜光学切面技术也揭示了奶粉可以保护喷雾过程中的益生菌。此外，以益生元（低聚果糖和聚葡萄糖）为载体代替部分脱脂乳也获得高的存活率。陆英等[3]研究表明出风温度越低，存活率越高，但水分含量也越大。出风温度为70℃时，水分达到5.14%，菌体存活率在2.02%；80℃时，水分达到4.11%，存活率则下降到1.54%。考虑到贮藏性，3%以上的水分含量偏高，易带来存活菌数快速下降的问题，因此应平衡产物水分与菌体存活率来选择出风温度。

在喷雾干燥技术中，应用热休克生理调节可能增加益生菌存活率，并能增强其适应能力。陆英等[2]对酪乳杆菌（Lactobacillus caseiBD-II）的抗热性以及不同热激条件对抗热性的影响进行了研究。通过实验确定了最适热激条件：菌龄7 h的细胞在热激温度50℃下处理45 min。在此条件下存活率为0.146%，较未处理细胞提高2.11倍。通过对加热诱导不同阶段的保加利亚乳杆菌的耐热性的研究发现，细胞热休克反应受菌龄和加热过程的影响，加热能诱导指数期细胞的耐热性，然而对稳定期没有影响。稳定期的细胞相对于指数期有更好的耐热性，热休克反应虽然增加了指数期细胞耐热性，但细菌存活率还是比稳定期低。

喷雾干燥技术由于其设备简单、成本低、易于推广、有利于大规模连续生产等优点而在益生菌制品生产中大量应用。对益生菌耐热性、存活率、储存期稳定性、细胞损伤位置和机理的研究将有助于最佳的益生菌制品。

2 冷冻干燥技术

冷冻干燥技术将湿物料或溶液在较低的温度（－10～－50 ℃）下冻结成固态，然后在真空（1.3～13 Pa）下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。物料的干燥在冻结状态下完成，与其他干燥方法相比，物料的物理结构和分子结构变化极小，其组织结构和外观形态被较好地保存，并具有优异的复水性，可在短时间内恢复干燥前的状态。由于干燥过程是在很低的温度下进行，而且基本隔绝了空气，因此有效地抑制了热敏性物质发生生物、化学或物理变化，并较好地保存了原料中的活性物质。因此，冷冻干燥技术是目前最好的保藏菌种方法之一，广泛用于益生菌制剂冻干粉和益生菌保藏菌种等方面。

益生菌冷冻干燥技术冻干是冷冻和干燥技术的有机结合，细胞在冻干过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，导致细胞膜物理条件或敏感蛋白结构的变化，使细胞活力下降[4]。微生物冷冻干燥期间细胞内外的水分冻结成冰，冰晶生长产生的机械力量会引起细胞机械损伤[4]。同时冻干引起溶质效应会使细胞水分溢出，具有生物活性的酶蛋白和抑制因子变性失活，细胞膜发生膜渗透性增加,使胞内的物质与胞外水溶性物质无控制地进行双向交换,从而造成细胞的代谢损伤[5]。冻干会使细胞膜上的脂肪酸发生变化,使细胞膜的完整性会受到破坏,微生物细胞因此出现损伤[6]。

许多研究发现在乳酸菌冻干前加入适当的物质能起到保护作用，冻干保护剂如甘油、聚乙二醇、氨基酸、糖类保护剂，不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率，还影响保藏期间的细胞稳定性[8]。对于绝大多数细菌冷冻干燥成功的关键在于有效保护剂的使用，保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性[9]。糖类保护剂如单糖、双糖、多糖等对微生物细胞的冻干脱水具有显著的保护作用。糖类保护剂中二糖的保护作用是近年来国内外学者研究的热点[10]。严佩峰[11]研究发现嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌冻干保护剂的最优配方为：脱脂乳10%、维生素C0.5%、谷氨酸钠0.5%、明胶1.5%。且在冷冻干燥过程中保护作用越好的冻干保护剂，其在保藏过程中的保护作用也越明显。在所选的6种冻干保护剂中，甘油的冻干保护效果最好，其次是麦芽糊精、蔗糖、维生素C、乳糖、谷氨酸钠。复合冻干保护剂对嗜酸乳杆菌冻干保护效果显著，最佳冻干保护剂组合为5%甘油、2%麦芽糊精、2.5%蔗糖。

由于温度的突然降低，微生物自身要经受一系列物理和化学变化，包括一系列蛋白的合成，称为冷应激蛋白。冷应激蛋白的存在使菌体的耐冷能力增强，这种过程可看成是微生物在低温条件下保护自己的一种机制。研究将乳杆菌经冷应激（10℃，5 h）处理后，菌体内出现一种分子量约6.3 ku的蛋白，而未经处理的乳杆菌不含这种蛋白，冷冻后的两种乳杆菌的存活率分别是83%和34%。许多研究者已经证明经过冷应激处理的菌体，冻干后的存活率明显的提高，但随着冻干后长时间的贮存，冷应激蛋白的作用会明显下降。李春[3]等以粪肠球菌为试验菌株，在迟缓期、对数期中期和末期3个阶段取样进行休克处理，未处理样为对照。结果表明：在对数期中期2 h冷休克处理的样品产生的休克蛋白高于4、8、24样品；10℃处理样品休克蛋白产生量高于20℃处理样品；对数期中期样品休克蛋白高于迟缓期样品。经一个月贮藏试验，10℃处理样品存活效果强于20℃和4℃；对数期中期取样（10℃，8 h）休克处理效果最好。

与气流干燥、喷雾干燥等其他干燥技术相比，真空冷冻干燥设备投资大，能源消耗及益生菌生产成本较高，因此该技术多运用于益生菌的保藏菌种和制作冻干粉。

3 包埋技术

包埋技术即给益生菌包裹在“保护衣”以抵御外界环境的侵害。益生菌的包埋技术包括以下两种：巨包埋技术、微胶囊包埋技术。巨包埋技术一般是利用硬胶囊包裹，将益生菌填装于空心硬质胶囊中或密封于弹性软质胶囊中而制成的固体制剂，空心硬质胶囊壳材料（即囊材）主要是明胶、甘油、水以及其它的药用材料。其能保护益生菌通过胃部，但是不易溶解，而且应用范围窄，只能用在胶囊型商品上，同时不耐久存。

微胶囊包埋技术作为保护益生菌免受外界环境侵害的最有效方法，已成为国内外的研究热点。所谓微胶囊技术就是利用天然的或者合成的高分子包囊材料，将固体的、液体的、甚至是气体的微小囊核物质包覆形成直径在1～5 000 μm范围内 （通常是在5～400 μm之间)的一种具有半透性或密封囊膜的微型胶囊技术。

益生菌制剂作为功能性食品，其包囊材料除要符合食品卫生法的有关要求，做到无毒无臭，同时包囊材料的选择对制剂产生改良作用。除传统的高分子聚合物如海藻酸钠、明胶、壳聚糖等[12]，利用淀粉较大的吸附能力和多孔淀粉的类似马蜂窝的独特中空结构将益生菌吸附包埋其中，从而起到减少细胞释放的作用。刘萍[13]运用微孔淀粉吸附乳酸菌，以海藻酸钠做壁材，CaCl2做固化液，用挤压法制备乳酸菌微囊。研究结果表明通过此方法制备的微胶囊不仅具有良好的耐酸性和肠溶性而且比单一用海藻酸钠作壁材时的活菌含量高，干燥后的微胶囊在室温条件下存储半个月后，每克样品的活菌量仍然达到105基数，具备了良好的存储稳定性。姚卫蓉[14]等研究发现多孔淀粉吸附活菌制备活菌粉，在非严格厌氧条件下加速储藏，菌体的存活性能要优越于不用多孔淀粉吸附直接冷冻干燥的活菌粉的。此外，明胶甲醛、虫胶、羧甲基纤维素钠和苯二甲酸醋酸纤维素等肠溶性包囊材料的筛选有利于防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道。研究采用虫胶-乙醇作为结合剂和涂膜剂制得含双歧杆菌的肠溶性颗粒。曹永梅等[15]将双歧杆菌粉与低聚糖及淀粉一起分散于熔化的氢化油脂中 (熔点在35℃左右)作为心材,明胶/果胶溶液作为壁材，制备肠溶性微胶囊制剂。

除了对益生菌包囊材料的研究，学者微胶囊的包埋形式进行了有益研究，研制出双层包埋技术、多层包埋技术，以利于益生菌在肠道内更好地靶标定殖。双层包埋技术是在乳酸菌表面包覆蛋白质，然后再包一层特殊胶体。利用这种特殊包埋技术，最外层的胶体在强酸性的胃酸中凝结，保护乳酸菌。当益生菌进入有较高pH值的十二指肠时，胶体自然分解溶化，释放益生菌，然后第二层的蛋白质就会促进益生菌与肠壁纤毛附着，同时提供益生菌繁殖所需营养。不仅可有效延长益生菌在产品保存期的活性，也保护益生菌不受胃酸的侵蚀而安全到达小肠、大肠后定殖产生功效。William[16]等研究发现双层包埋益生菌具有耐久存、耐酸和优越的热稳定性。王荻[17]等发明了以海藻酸钠、氯化钙和壳聚糖为微胶囊包被材料，以乳酸菌或双歧杆菌为囊芯物，利用海藻酸钠与氯化钙发生离子交换形成海藻酸钙包被，再利用海藻酸钙与壳聚糖等电点不同使壳聚糖在海藻酸钙表面形成二次包被，低温冷冻干燥后制成多层包被益生菌微胶囊，以达到长期保存并能在肠道定位释放的效果。陈健凯[18]等采用双层包埋方法，以牛奶蛋白为内层包埋剂，K-卡拉胶和刺槐豆胶为外层包埋剂，对嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌进行双层包埋。结果表明，双层包埋乳酸菌在上述试验条件中比未包埋乳酸菌保持更高的存活率，显示出用这种双层材料包埋的乳酸菌具有稳定的生物活性，耐久存，耐胃酸，耐60℃高温，适于在酸奶中应用。戚薇等[19]采用双层包埋法对益生菌进行了微胶囊化。他们先以明胶、黄原胶、果胶等为复合胶体，包裹菌体形成耐酸的保护层，再用壳聚糖/海藻酸钠符合体系通过表面交联形成耐酸性能更好的双层微胶囊。结果表明在使用明胶和黄原胶双层包埋的微胶囊，常温储存半个月后，活菌数仍然高达2.3×1010cfu/g。

在囊化的益生菌培养过程中会遇到胶粒的稳定性问题使得细胞从胶粒中释放出来，从而引起下批发酵时初始细胞数的下降。因此，改善胶粒稳定性的问题成为微胶囊包埋技术的关键。研究者在此方面做了许多研究。用阳离子聚合物进行交联。海藻酸钠的胶粒通过与阳离子聚合物交联，使海藻酸钠变得稳定。这些阳离子聚合物在胶粒周围形成膜，用戊二醛喷洒胶粒一直被认为是减少细胞释放的稳定技术。研究者采用4%的壳聚糖和1,6－二异氰酸酯或戊二醛交联形成的膜，获得了强度较大的微胶囊，这种双功能剂和壳聚糖的反应形成了连接壳聚糖分子的桥，桥的长度取决于交联剂的类型。用高浓度的明胶和2,4-二异氰酸甲苯交联，去包囊乳酸乳球菌乳脂亚种取得了同样的结果[20]。用壳聚糖、聚赖氨酸等聚合物涂膜。有报道用壳聚糖在海藻酸钠胶粒表面裹膜，发现将海藻酸钠胶粒悬浮在低分子量的壳聚糖溶液中形成膜后，细胞释放可以减少40%。还发现低分子量的壳聚糖比高分子量的更易渗透到海藻胶基质中，形成更加紧密的膜。研究用聚赖氨酸对胶粒进行包膜的实验，聚赖氨酸有较好的生物相容性，可以应用于食品工业，如酸奶的生产。但研究指出，用单层的聚赖氨酸涂膜海藻酸钠胶粒时减少细胞释放的作用不明显，但用聚赖氨酸双层涂膜时可以减少近50%的细胞释放[21]。

4 讨 论

益生菌制剂加工技术对提高益生菌制剂质量有至关重要的作用，深刻影响着益生菌制品产业化发展。各项技术的优化和技术间的联合运用有利于改良益生菌制剂的加工技术。如将微胶囊技术与喷雾干燥、冷冻干燥技术联合使用的研究，微胶囊化益生菌能提高对环境的适应性，对干燥和冷冻环境的耐受性，益生菌微胶囊化后进行喷雾干燥，冷冻干燥能提高活菌数；优良壁材的筛选研究，如与益生菌有更好相容性的壁材、包囊材料之间复配研究，或通过化学修饰等功能性改造，以更好创造益生菌保持活力的微环境等；包囊的益生菌作为发酵剂以优化发酵和生产液体制剂工艺等方面都值得进一步研究探索。

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Survey and outlook of the processing technology of probiotics

HU Shan1，HU Shi-jun1，WU Qing-ping2，LUO Hua-jian1LIANG Wei-qu1，LUO Shi1，CHEN Shi-li1
（1.Dongguan Agricultural Research Center,Dongguan 523086，China；2.Guangdong Institute of Microbiology,Guangzhou 510070，China）

The processing technology of probiotics is the keyword of improving the product and enhancing the health function.This paper is a survey and outlook of the processing technology of Probiotics,including spray-drying,freeze-drying,embedding.In spray-drying,it would be improved the probiotics to optimize the craft of parameters,study the heat shock protein and the cellular injuries site and mechanism.The freeze-drying focus the research on cryoprotectant and cool shock protein.The microencapsulation research include improving embedded material,double-coated technology

probiotics；spray-drying；freeze-drying；microencapsulation

Q93-33

B

1001-2230（2010）03-0047-04

2009-11-02

粤港关键领域重点突破项目招标东莞专项(2007168603)。

胡珊（1981-），女，硕士，从事微生物方面的研究。

梁卫驱