次氯酸介导的氧化应激及其病理生理学意义

李婷婷，彭 军

(中南大学药学院药理学系，湖南长沙 410078)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是具有高反应活性的一类含氧自由基或分子的总称，主要包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢(H2O2)、氢过氧化物和次氯酸(hypochlorous acid，HClO)等。生理条件下，细胞内ROS的水平被控制在很低的范围，在抗菌、抑制炎症反应和抑制肿瘤等方面具有积极意义，且对氧化还原信号传导通路中敏感的蛋白激酶具有调节作用。但在疾病状态或机体遭受某些损害性刺激时，ROS的生成迅速加快并在体内蓄积，引起氧化应激损伤。

HClO是ROS中的一种强氧化剂，主要由活化的中性粒细胞和巨噬细胞产生，具有很强的杀菌作用，杀菌能力约为H2O2的50倍。基础水平的HClO对于机体抵御外来病原体的入侵具有积极意义，但HClO水平过高时则会诱导氧化应激对机体造成损伤。越来越多的研究表明，HClO在动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、高血压、心力衰竭和糖尿病等许多疾病病理变化中起着重要作用［1－2］。

1 次氯酸的来源及生物学特性

早期研究认为，机体内的HClO主要由中性粒细胞和单核巨噬细胞中的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)催化生成。MPO主要功能之一为催化H2O2与氯化铁反应生成HClO。新近在人和鼠的血管内皮细胞和平滑肌细胞中检测到一种含有血红素成分、对过氧化物酶抑制剂高度敏感的酶，它也能催化H2O2生成HClO，命名为血管过氧化物酶(vascular peroxidase，VPO)。VPO至少包括 VPO1和 VPO2亚型，前者在人和鼠的心脏、血管内皮细胞及平滑肌细胞中均中均高表达，而后者只在人的心脏中表达，与前者有63%的同源性［3］。VPO可能是心血管系统中产生ROS的主要催化酶之一。

HClO是一种中性小分子，可以自由通过细胞膜，也很容易接近病菌，其氧化性极强，性质高度活泼，在机体抵御病原微生物等入侵中发挥着重要作用。HClO能直接渗入到细菌和病毒体内，与其蛋白质、核酸和酶等发生氧化反应，从而杀死病原微生物。体内的HClO部分以次氯酸盐的形式存在，次氯酸盐一方面促进细胞内溶酶体、吞噬体的融合，增强其杀伤吞噬微生物的功能;另一方面，次氯酸盐可灭活组织和血液中的蛋白酶抑制因子如α1-抗胰蛋白酶(α1-antitypsin)，使中性粒细胞释放溶解性蛋白酶，以降解外来蛋白。MPO的抗菌(包括抗细菌、真菌和病毒)活性可能继发于HClO的作用［4］。由于HClO具有很强的氧化特性，当病理情况下HClO的生成过量时，则会引起氧化应激，对组织细胞造成损害，参与AS、细胞凋亡和衰老等多种病理生理过程。

2 次氯酸与动脉粥样硬化

HClO介导的氧化应激通过炎症反应参与AS的形成已被广泛报道，但由于HClO的不稳定性不易被检测，可用MPO的水平间接反映HOCl水平。研究表明，AS斑块中存在MPO表达，急性心肌梗死和不稳定型心绞痛患者MPO水平显著高于正常人群及稳定型心绞痛患者，提示MPO可作为一种预测急性冠状动脉综合征的生物标志分子［1］。此外，用HClO孵育大鼠颈总动脉可诱导内膜和中膜细胞凋亡，随后出现血管增殖性反应，导致新生内膜中异质细胞群形成，这与粥样斑块形成中出现的血管损伤非常相似。新近研究表明，HClO可通过损伤血管内皮功能、氧化修饰脂蛋白和增加斑块的不稳定性等多条途径促进AS形成［5－6］。

2.1 次氯酸与血管壁损伤

动脉内皮细胞受损及其功能障碍是AS的始动环节，①HClO可通过多条途径促进血管内皮细胞损伤，延缓其修复:HClO能抑制金属蛋白酶组织抑制因子1的活性，从而激活动脉壁基质裂解蛋白，使基质蛋白聚糖降解，减少细胞外基质与内皮细胞的黏附，促进内皮细胞受损、脱落，启动粥样硬化病变;②HClO的氧化产物之一，3-氯酪氨酸通过增加超氧阴离子生成和活化胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)途径促进人主动脉平滑肌细胞迁移［7］，从而加速 AS的发展;③HClO诱导生成的高级氧化蛋白产物(advanced oxidative protein products，AOPP)通过激活p38 MAPK途径上调单核细胞趋化因子1的表达，促进单核细胞趋化活化，导致受损血管壁炎症细胞浸润［8］。

2.2 次氯酸与脂质氧化

低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)是肝脏合成的内源性胆固醇及胆固醇转运到周围组织的主要形式，在AS早期被巨噬细胞吞噬，形成泡沫细胞沉积于血管内膜下，促进AS的发生发展。然而，巨噬细胞几乎不能吞噬原形LDL形成泡沫细胞。LDL必须经过氧化修饰变成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)才能成为巨噬细胞的吞噬对象。LDL可诱导过氧化物酶的活性，增加HClO产量，HClO作用于LDL酪氨酸残基产生酪酰基自由基，进而诱发LDL氧化的链式反应，产生ox-LDL。研究证实，能生成HClO的内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞均能产生ox-LDL。ox-LDL可以通过促进中性粒细胞黏附和细胞因子如集落刺激因子、血管平滑肌生长因子和单核细胞化学趋化因子等表达损伤动脉内膜，导致内皮功能障碍［4－5］。

HClO除了氧化LDL，还能氧化修饰抗粥样硬化的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，HDL通过将胆固醇从巨噬细胞中移出和抗LDL氧化来延缓AS。HClO氧化破坏HDL的盘状结构组装［5］，并加快其结构的重建和融合，对血清中球形结构的HDL也有类似的破坏作用，大大减弱了HDL抗粥样硬化能力。HDL可分为多个亚类，但各亚类均呈现出类似的HClO内在氧化易感性［9］。HClO还可影响其胆固醇的逆向转运作用。研究发现，HClO能使载脂蛋白A-Ⅰ发生氧化修饰，降低了其促进胆固醇的逆向转运作用［10］。

2.3 次氯酸与粥样斑块破裂

HClO可降解细胞外基质，使纤维帽变薄，同时激活金属蛋白酶，增加斑块表面的不稳定性，使斑块易于破裂。HClO促进斑块破裂的机制复杂多样，如通过基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)调节纤维帽厚度:AS发展到后期，随着脂肪斑的增大，组织可分泌MMP来分解脂肪斑顶层的组织，使其内容物释出，HClO破坏MMP-7的前驱物，分解其半胱氨酸中硫与锌的结合键，使酶活性区域暴露，加速脂肪斑周围组织的破坏及消化。HClO也通过诱导内皮细胞凋亡引起内皮脱落，导致斑块糜烂并使斑块易损性增加，促进冠脉综合征的发生［6］。此外，亚致死浓度的HClO可诱导内皮组织因子的表达，促进血栓形成［11］。

2.4 次氯酸与血管新生内膜形成

新生内膜的形成是血管内膜炎症反应后出现的血管异常增生，在AS中普遍存在。新生内膜中最主要的细胞成分为平滑肌细胞，而这些平滑肌细胞在表型和基因表达方面都不同于中膜的平滑肌细胞，其表型为合成型，分泌和表达细胞外基质、趋化因子和有丝分裂原蛋白，参与血管重塑。体外研究发现，HClO可引起血管内膜和中膜细胞凋亡以及凋亡后反应性异常增生形成新生内膜，明显降低血管弹性［7］。用HClO处理过的血管无论组织学还是功能特性与AS斑块都十分相似。

3 次氯酸与细胞凋亡

HClO 20 ～50 μmol·L－1可迅速诱导细胞凋亡，表现出一系列典型的凋亡标志，包括膜联蛋白V标记、胱天蛋白酶活化、染色质浓缩和细胞体积缩小等［12］。HClO的清除剂牛磺酸可有效阻止血管内皮细胞的凋亡。有趣的是，HClO氧化来源的ox-LDL可通过线粒体途径诱导外周血单核细胞和U937单核细胞凋亡，但无法诱导单核源性巨噬细胞凋亡［13］，其机制尚不明确。HOC1诱导细胞凋亡可能涉及 Bcl-2，Bax，JNK，p-JNK，P53，Fas和胱天蛋白酶的活化等，例如HClO诱导的胆管上皮细胞凋亡即浓度依赖性增加胱天蛋白酶3活性及P53和p-JNK的表达［14］。

线粒体氧化应激在细胞凋亡中起着不可替代的作用，HClO对线粒体的氧化损伤很可能是其促凋亡的一个重要途径，新近开发的线粒体抗氧化剂MitoQ和SS31可显著抑制细胞凋亡［15］。

3.1 次氯酸对线粒体渗透性转运孔的影响

线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)是线粒体内外信息交流的中心枢纽，它的开放是细胞凋亡的早期事件。HClO诱导线粒体功能障碍和细胞凋亡依赖于其诱导线粒体通透性转运功能的变化。HClO主要通过氧化MPTP上的氧化还原敏感位点如二硫键部位引起线粒体肿胀和崩解以及膜电位改变，从而诱导MPTP通透性改变，此过程伴有细胞色素c的释放。

Bcl-2家族对凋亡的控制可通过调控MPTP的关闭和开放来实现的。研究显示，Bcl-2蛋白可能是HClO的直接或间接靶点。HClO可迅速下调内皮细胞中Bcl-2的表达、促进Bcl-2蛋白降解，其具体机制有待进一步研究。Bcl-2可通过增加胞内的还原性物质如谷胱甘肽(glutathione，GSH)，升高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的比值，促进GSH进入核内而影响细胞的氧化还原状态。应用HClO后，细胞内GSH水平迅速降低，可能与HClO降解Bcl-2蛋白相关。研究发现，HClO诱导人间质祖细胞的凋亡时，HClO可迅速诱导Bax蛋白构象发生变化，线粒体膜通透性改变，导致细胞凋亡［16］。

3.2 次氯酸与凋亡信号分子

HClO能诱导胱天蛋白酶活化，促进细胞凋亡［17］。多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一种重要的DNA修复酶，在细胞凋亡早期的监测和修复中起了关键作用。PARP是胱天蛋白酶家族(如胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7)的作用底物，后者可使PARP的DNA修复功能丧失。采用免疫印迹分析方法的研究表明，HClO可增强内皮细胞胱天蛋白酶3的活性，加速PARP的降解，从而促进细胞凋亡。

钙离子作为第二信使在细胞凋亡信号传导中起着重要作用。HClO能浓度依赖性地激活肌浆网钙离子释放通道，导致快速钙释放。HClO的神经毒性与细胞内钙离子浓度的增加密切相关，钙通道拮抗剂和钙离子螯合剂能阻止α-胞衬蛋白裂解和细胞凋亡［18］。钙蛋白酶是一种降解蛋白质的酶，主要作用是降解肌肉中各种蛋白质，其活性受肌细胞中钙离子的浓度影响，钙离子可以激活此蛋白。钙蛋白酶激活后可以使收缩蛋白部分降解，肌丝反应性降低，引起肌细胞收缩功能抑制。研究发现，HClO可通过激活钙蛋白酶和诱导溶酶体破裂，促进皮质神经元凋亡。

4 次氯酸与细胞衰老

细胞衰老是指组成细胞的物质在运动中不断受到内外环境的影响而发生损伤，造成功能退行性下降而老化，是新陈代谢的自然现象。细胞衰老时会出现DNA复制与转录受抑制、蛋白质含量下降、酶活性降低和代谢速率变慢等一系列变化。研究发现，HClO 1 ～10 μmol·L－1可加速年轻细胞的衰老，而HClO 0.1 ～1 mmol·L－1可直接引起细胞膜溶解，导致细胞死亡。而年老细胞对低浓度HClO敏感，HClO 1 μmol·L－1即可引起卵母细胞死亡［19］。

HClO能抑制促进细胞生长发育的某些重要蛋白质表达。蛋白质表达的过程涉及基因转录、mRNA出核转运及以mRNA为模板的蛋白质翻译等环节，位于核被膜的核苷三磷酸酶是细胞核mRNA出核转运的主要限速酶。ATP或GTP作底物时，HClO 1 nmol·L－1～5 μmol·L－1浓度依赖地抑制肝细胞核核苷三磷酸酶活性，抑制蛋白质表达［8］。

含巯基的蛋白质在许多重要代谢反应中起关键作用，也参与衰老相关信号传导系统。巯基是HClO主要作用靶点之一，HClO对巯基的氧化修饰通常造成其不可逆损伤。GSH等抗氧化剂可减轻HClO诱导的蛋白质损伤。GSH含量的降低可能在衰老机制中起了重要作用，在缺乏GSH情况下，无论整体、细胞还是提取的蛋白质受HClO的损害都要严重得多［20］。

此外，HClO可引起骨骼肌肌浆网损伤，HClO呈浓度依赖性抑制肌浆网中Ca2+-ATP酶活性，某些抗氧化剂如银杏叶提取物761等可保护Ca2+-ATP酶免受HClO的氧化修饰，其机制可能为阻止HClO对巯基的破坏，抗氧化剂和Ca2+-ATP酶保护剂可对HClO所致衰老作用提供双重保护［21］。

5 结语

综上所述，病理条件下HClO可通过多条途径对组织细胞造成损伤。一方面HClO本身是强氧化剂，可对机体多种生物大分子物质如蛋白质、核酸和脂肪等直接造成氧化损伤;另一方面，HClO还可能作为一种信号分子参加了细胞凋亡和衰老等多条信号传导途径。阐明HClO在这些信号途径中的作用和机制，可能为许多疾病的防治提供新的作用靶点。维持基础水平的HClO对机体是必要和有益的，阐明HClO代谢调节机制，防止HClO的过度聚积，则可预防和缓解HClO对组织细胞造成的损伤。

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