雄性受体小鼠性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响

彭南妮，薛立群，袁安文，凌理军，吴珊

(1.湖南农业大学动物医学院与动物科技学院，长沙 410128; 2.深圳市罗湖区人民医院生殖医学中心，深圳 518000)

研究报告

雄性受体小鼠性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响

彭南妮1，2，薛立群1，袁安文1，凌理军1，吴珊1

(1.湖南农业大学动物医学院与动物科技学院，长沙 410128; 2.深圳市罗湖区人民医院生殖医学中心，深圳 518000)

目的探索雄性受体性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响。方法将1日龄小鼠卵巢移植入成年雄鼠肾囊下，将雄性受体小鼠分为性腺摘除组和性腺在位组，于21 d回收移植卵巢，以评价雄性小鼠性腺对新生小鼠卵巢移植体卵母细胞生长发育的影响。结果移植后21 d，性腺摘除组和性腺在位组卵巢回收率分别为80.0%和92.9%，移植体生长增大;每个卵巢平均回收卵母细胞数分别为(30.4±4.3)和(42.4±11.1)个，两者差异不显著(P＞0.05);性腺摘除组回收的均为GV期卵母细胞，性腺在位组大部分为GV期卵母细胞，有的达到MII期。结论雄性受体小鼠能够支持移植卵巢卵母细胞的生长发育，雄性受体的性腺对其影响不明显。

小鼠;移植;性腺;卵巢;卵母细胞

卵巢移植被认为是延续和保存雌性生殖能力的一种有效方法，研究表明，在雌性受体中卵巢同体、异体和异种移植能够存活、排卵和维持性周期［1，2］，并可利用原位移植或体外受精辅助生殖技术获得新生后代［3～5］。与此同时，研究还发现成熟卵巢异性移植可获得更多的卵泡发育效果［6，7］;在正常雄性受体中新生仔鼠幼稚型卵巢移植体可以发育成熟和产生有腔卵泡［8］，并在促性腺激素的刺激下可以诱导卵母细胞成熟［9］。然而，在Cox等［10］的研究中发现，将16日龄胎儿、3和10日龄新生小鼠卵巢移植到成年雌鼠肾囊下，受体切除或保留自身卵巢，28 d后移植体的卵泡发育方式在切除卵巢的受体中与原位成鼠卵巢相似;在保留自身卵巢的受体中，胎儿和3日龄新生小鼠卵巢的移植体卵泡发育未超过早期有腔阶段，但10日龄新生小鼠卵巢的移植体卵泡充分发育，移植后8周形成黄体。这表明在雌性受体中，受体自身卵巢可影响移植卵巢卵泡的发育。尽管卵巢移植体在雄性受体内可以维持卵泡及卵母细胞的发育，但雄性受体性腺对卵巢移植体的卵母细胞发育是否存在影响尚缺乏足够的了解。为此，本研究通过比较卵巢卵母细胞在去性腺受体小鼠和保留性腺受体小鼠中生长发育能力差异，探索雄性受体性腺对移植卵巢卵母细胞生长发育的影响，并为发展初生期卵巢异性异位移植技术积累基础资料，为深入探讨影响卵巢及卵母细胞生长发育的基本生理因素提供新实验模型。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组:昆明小鼠来源于中南大学实验动物学部【SCXK(湘)2006—0002】，采用1日龄雌鼠作为卵巢供体，10～12周龄雄鼠作为卵巢移植受体，随机将卵巢移植受体分为摘取性腺组(Ⅰ组，5只)和性腺在位组(Ⅱ组，6只)进行。实验小鼠在自然光照、22～25℃环境温度条件下饲养;自由饮水、采食，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 主要试剂与仪器:Leibovitz 15(L－15) (Invitrogen)，新生牛血清(NBS)(北京鼎国生物科技有限公司)，L15*:L15+10%NBS+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL链霉素。体视显微镜(Motic，SMZ－168)，显微照相系统(Motic，Moticam 350)，洁净工作台(苏净集团安泰公司，VS－1300L－U)，倒置显微镜(Leica，DMIL)。

1.2 实验方法

1.2.1 供体卵巢采集:断颈处死1日龄供体雌鼠，体视显微镜下摘取卵巢，放入L15*液中，去掉卵巢周围的包膜，显微照相，放入L15*液中备用。

1.2.2 肾囊下卵巢移植、受体性腺摘除和移植体回收:肾囊下卵巢移植参照Liu等［11］的方法，受体腹腔注射1%戊巴比妥钠每只0.25～0.3 m L，进行全身麻醉，背部剪毛，沿背中线剪开皮肤，钝性分离皮下组织，在腹壁剪一小口，暴露左肾脏，用一锐利镊在肾囊上撕开一个小口，用自制玻璃吸管吸住卵巢送入肾囊下，移植卵巢2～3枚(Ⅰ组共移植10枚，Ⅱ组共移植14枚)，还纳肾脏，缝合切口(图1)。操作在洁净工作台中体视显微镜下进行。移植完成后，将实验I组小鼠的性腺摘除。雄性受体阴囊处用75%的酒精消毒，剪开一小口，稍挤压腹部，暴露两侧睾丸。将睾丸和副睾钝性摘除，在摘除后用青、链霉素消毒，缝合切口。以移植当天为第0天，于移植后第21天断颈处死受体，取出卵巢移植肾，对移植卵巢(移植体)进行形态学观察。

1.2.3 受体的一般状态观察:对受体进行常规饲养，观察受体手术后的活动、饮食及切口愈合情况。

1.2.4 移植卵巢形态学观察:观察1日龄卵巢、移植体的形态与生长发育状况，并在体视显微镜下进行显微照相。

1.2.5 卵母细胞的收集与形态学观察:将移植体从肾囊内剥离出来，放入L15*液中，在体视显微镜下用4号针头刺破有腔卵泡，释放出卵母细胞［3］，在倒置显微镜下进行形态学评价、显微照相，记录各组收集的卵母细胞数。

2 结果

2.1 受体鼠术后一般状态观察

在保温条件下，受体鼠均于施术1～4 h后逐渐苏醒，无1例死亡。术后受体鼠恢复活动，摄食正常，手术切口无感染，愈合良好。

2.2 卵巢移植体的回收与形态学观察

I组和II组卵巢回收率分别为80.0%(Ⅰ组回收8枚)和92.9%(Ⅱ组回收13枚)，经卡方检验，组间差异不显著(P＞0.05)。刚分离的1日龄卵巢呈肾形，浅黄色，富含血管(图2);移植21 d后，两组中卵巢移植体均生长增大，呈圆形或肾形，乳白色，表面有网状血管分布(图3、4)，有的移植体表面可见透明小点，体视显微镜下可辨其为大的有腔卵泡(图4);卵巢移植体能从移植部位剥离下来(图5、6)。

2.3 卵母细胞的回收和形态学观察

I组和II组中每个卵巢移植体平均回收卵母细胞数分别为30.4±4.3和42.4±11.1，经t检验，组间差异不显著(P＞0.05)。

两组中，回收卵母细胞大部分为裸卵，处在GV期，生发泡(germinal vesicle，GV)明显(图7);有的有卵丘细胞包裹，为卵丘－卵母细胞复合体(图8);在II组中，有少数移植体可回收到排出第一极体(First polar body，pb1)的卵母细胞，说明其已经完成了第一次成熟分裂，达到了M II期，为成熟卵母细胞(图9)。

3 讨论

在本实验中，去性腺组和性腺保留组受体小鼠的卵巢移植体均生长增大，移植卵巢的回收率达80.0%以上，说明雄性受体小鼠的生理环境也能够很好的支持1日龄卵巢的生长发育，满足新生鼠未成熟卵巢发育的基本需求，提示卵巢移植受体的性别差异因素并不明显影响未成熟卵巢的发育及成熟，在两性分离的动物个体中性别以外的生理因素仍是保证卵巢及卵母细胞生长发育的基础。此外，肾囊下移植部位的特殊性也为卵巢移植体的存活和发育提供了基本保障。肾脏血管丰富，宜于移植体发生血管再生;同时，新生小鼠卵巢的免疫原性低［12］，肾囊下被认为是一个免疫缺陷区［13］，使移植卵巢能在移植期内生长增大，免疫排斥不明显。

相关报道表明，以雌性动物为卵巢移植受体时，移植未成熟卵巢组织的卵泡发育受供体卵巢的年龄和受体的性腺状态影响［10，14，15］。在保留自身卵巢的受体，胎儿和3日龄卵巢的移植体卵泡发育未超过早期有腔阶段，但10日龄卵巢的移植体卵泡充分发育［10］。然而本实验未能观察到雄性受体性腺对新生小鼠卵巢移植体具有显著阻止腔卵泡发育的影响。1日龄小鼠卵巢异位移植到去性腺和保留性腺的雄性成年小鼠中，卵泡能从原始卵泡阶段发育到有腔卵泡阶段，回收到GV期卵母细胞，并且平均回收卵母细胞数差异不显著，说明雄性小鼠性腺不对移植卵巢卵泡的生长发育产生明显的抑制性影响。因此，在卵巢异性移植中保留雄性受体性腺不仅可以简化卵巢移植手术过程，而且能够保证卵巢移植的成功率。

本实验中，摘除性腺的雄性受体中未发现成熟卵母细胞，而性腺在位的移植体卵巢中有生长发育到第一极体的卵母细胞。这可能与雄激素具有促进卵母细胞成熟的作用有关。Hammes［16］的研究认为睾酮是哺乳动物卵母细胞成熟的促进剂，Gill等［17］研究也表明性腺类固醇能够调节哺乳动物卵母细胞减数分裂。

(本文图1～9见彩插8。)

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Effect of Gonad of M ale Recipient on the Developm ent of A llografted Ovaries and Their Oocytes

PENG Nan－ni1，2，Xue Li－qun1，YUAN An－wen1，LING Li－jun1，WU Shan1
(1.College of Veterinary Medicine and Animal Science＆Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China;

Objective To investigate the effect of gonad of male recipient on development of neonatal ovary allograft and its oocytes.M ethods The ovaries from one－day－old mice were transplanted underneath the kidney capsule of male recipient with or without gonad.The ovarian grafts were collected at 21 days after transplantation and examined by histopathology.ResultsIt was found that the ovarian grafts increased in size，the recovery rate and average number of oocytes collected from each graft in both groups were 92.9%and 80.0%，42.4±11.1 and 30.4±4.3，respectively.The difference was not significant(P＞0.05).The oocytes collected from the grafts in castrated male recipients were at the GV stage，and except a few at metaphase II stage most of the oocytes in intact male recipients developed at GV stage..ConlusionThe results indicate that the grafted ovarian oocytes can develop in male recipient mice and the gonad of male recipient has no significant effects on oocyte development.

Mouse;Transplatation;Gonad;Ovary;Oocytes

Q813.3

A

1005－4847(2010)02－0142－03

2009－08－25

湖南省重点科技项目(编号:01NKY1002－01);湖南省科技厅计划项目(编号:2007TP4024)。

彭南妮(1964－)，女，研究方向:生殖医学。E－mail:nnpeng@126.com

袁安文。E－mail:yuananwen@yahoo.com.cn

2.Reproductive Medicine Center of Luo－Hu Hospital Shenzhen，Shenzhen 518000，China)