热休克蛋白免疫学效应与应用研究进展*

王景锋,邵军军,常惠芸,郝峰强

热休克蛋白(heat shock protein,HSP),又称应激蛋白(stress protein,SP),是一组广泛表达于原核和真核生物细胞中,在进化上高度保守的蛋白质。自从上个世纪70年代由美国学者Tissieres等发现以来,生物学界科学家对HSP的生物学功能进行了广泛深入研究。人们发现,HSP的生物学功能广泛.主要表现在:①HSP在应激条件下维持细胞内必需蛋白质的空间构象,从而保护细胞生命活动,确保细胞生存;②在蛋白质折叠、跨膜运输、转位、细胞骨架及核骨架稳定等基本功能方面也发挥着重要作用,主要是调节相关蛋白的活性和功能,而自身并不参与大分子蛋白组成。故称其为“分子伴侣”(molecular chaperones)。目前,根据同源性及分子量大小的不同,可将 HSP分为以下若干家族:HSP90家族(83-90 k D)、HSP70家族(66-78 k D)、HSP60家族及小 HSP家族(15-30 k D),此外还有分子量在 100-110 k D的大分子HSP〔1〕。近些年来,科学家们逐渐发现HSP在机体正常情况下免疫耐受的维持和免疫应急条件下的抗原递呈及免疫应答方面发挥着重要作用。所以,HSP成为了目前众多免疫学家关注的热点,对其免疫学效应做了全面的研究,并由此引发了HSP被广泛应用于新型疫苗研制的研究。本文就相关内容作一综述。

1 热休克蛋白在抗原递呈中的作用

众所周知,经典的抗原递呈理论认为,外源性抗原主要是通过内噬途径(endocytic pathway)被高水平表达MHCⅡ类分子的专业抗原递呈细胞(professional antigen-presenting cells,pAPCs)或非专业性抗原递呈细胞(nonprofessional APC)内化并在细胞内被加工和处理后,以与MHCⅡ类分子形成复合物的形式运送到细胞表面供TH细胞所识别。然而,早在1976年,Bevan的发现使得这一经典理论受到挑战,他发现外源性抗原也能够被pAPCs通过MHCⅠ类分子递呈给细胞毒性T细胞,进而刺激抗原特异性CD8+T淋巴细胞的活化。但是这一发现在当时并没有引起人们的重视。直到1988年,Moore和Yewdell的研究成果才使的Bevan的发现得到进一步的确认。此后,研究者们将这一外源性抗原通过MHCⅠ分子递呈的现象称为抗原的交叉递呈(cross-presentation),交叉递呈的抗原刺激活化CD8+T淋巴细胞的过程称为 T细胞的交叉致敏(cross-priming)。从此,抗原交叉递呈现象逐渐得到免疫学界的重视。截至目前,人们对于抗原交叉递呈的具体分子机制还不清楚,但免疫学界普遍认为,外源性抗原主要是被APC吞噬形成吞噬体进入细胞内部,此后这些抗原从吞噬体内移位到胞浆中,进而抗原进入内质网通过MHCⅠ类分子被递呈。

然而,近些年来,人们发现HSP蛋白参与了抗原交叉递呈过程,而且可能起到关键性作用。Srivastava等的开拓性的研究发现,许多HSP所具有的分子伴侣作用在机体抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈过程中发挥着重要作用〔2〕。此外,有学者在研究淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒核蛋白(lymphocytic choriomeningitis virus nucleoprotein,LCMV-NP)的交叉递呈机制时发现,当用HSP90抑制剂格尔德霉素(geldanamycin)和除莠霉素(herbimycin)处理细胞后,细胞交叉递呈LCMV-NP的能力明显下降,所以认为HSP90具有促进抗原交叉递呈的功能。但其中的具体机制还待进一步研究。最近的研究表明,交叉递呈过程中APC对HSP-抗原肽复合物或HSP其自身的摄取主要是通过由相关受体介导的内吞作用过程进行的。而且HSP受体现已被鉴定,如CD91分子,它可结合HSP70和 HSP90家族的许多成员。

2 免疫应急诱导HSP的产生

我们已经熟知,当细胞受到热刺激时,HSP在细胞内的表达量会明显增加。同样地,细胞在受到病原感染或在发生癌变时,细胞中的HSP的表达量也会发生较大的变化。

Sedger等发现,当痘苗病毒感染小鼠后在小鼠卵巢中增殖过程中使得卵巢组织中的HSP72表达量明显增加〔3〕。Hickman等报道了人T细胞在受到HIV病毒感染后,细胞内HSP27的表达量明显提高。与此同时,HSP27的某些肽段被HLA-B分子递呈到细胞表面,而且递呈的量与感染前相比明显增加〔4〕。此外,人们也发现麻疹病毒感染可以诱导感染细胞中HSP90表达量的增加,而且HSP90的某些肽段可被HLA-A分子结合并在细胞表面展示递呈。由此,人们已经认识到,机体的免疫细胞或其他细胞在受到某些病毒侵染时,细胞内HSP能够被诱导大量表达,而且这些HSP可通过细胞内源性抗原递呈系统得到递呈,即HSP衍化而来的某些肽段被细胞中的MHCⅠ类分子结合后在细胞表明展示,进而诱导机体的免疫应答。而Zheng等的研究发现,大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染引起凋亡的中性粒细胞在被巨噬细胞吞噬后能够使吞噬细胞活化并产生大量的炎性细胞因子TNF-α,而他们进一步的研究发现,这种效应并不是由感染中性粒细胞的细菌所导致,而是细菌感染导致凋亡的中心粒细胞中大量表达的HSP60和 HSP70诱导了巨噬细胞的活化,由此认为,HSPs可以作为机体在免疫应急条件下的一种危险信号,它们可以调动机体的免疫系统清除威胁〔5〕。

肿瘤是机体在内、外因素作用下发生的与机体生长不相协调的异常增生群,具有无限增殖的特点,肿瘤的发展过程需要大量HSP来调节。正常细胞中仅表达少量热休克蛋白参与细胞的生长代谢,并受细胞内调节机制的严格调控,而肿瘤细胞即使在无应激的条件下,也能独立于细胞周期持续组成型表达热休克蛋白,并出现异常分布及定位。这种非正常性的高表达可能还与化疗耐药性有关,而且肿瘤侵袭性越强、恶性程度越高,热休克蛋白表达也越多。据文献报道,HSP60、70、90α在直肠癌中均呈过度表达,与癌的发生发展密切相关,而且认为监测HSPs过度表达对直肠癌的预后判断有一定意义。Cappello等的研究也表明,HSP70在宫颈癌、结肠癌的发生模型中呈过度表达,HSP60在人前列腺癌组织中呈过度表达,且癌的越早期阳性表达率越高,故他们认为HSP70、60在癌的发生机制上起重要作用〔6〕。此外,人们在胃癌、宫颈癌及骨肉瘤细胞中都观察到HSP70表达量上升的现象,而HSP27在食管鳞癌细胞中的表达量也明显增加。目前,人们普遍认为热休克蛋白在癌细胞中呈过度表达是因为这些细胞中变形蛋白的量增加,细胞为了挽救自身,从而大量表达HSP,使得HSP发挥其分子伴侣作用,以改善细胞内蛋白的状态。然而,HSP蛋白的过量表达,一方面是某些癌症发生发展的重要标志;另一方面,HSP过量表达的同时,HSP通过内源性抗原递呈系统递呈的量也明显增加,这就为免疫系统识别癌细胞提供了靶标。

3 HSP与机体免疫应答

由上文我们了解到,HSP作为机体重要的应急蛋白在机体免疫应急条件下一般被大量诱导产生,而这些HSP广泛参与了机体对机体内外免疫原做出的免疫应答反应。

3.1 HSP与机体适应性免疫应答 病毒感染和癌变等细胞应急条件使得细胞通过MHC分子递呈到细胞表面的抗原肽发生变化,从而介导免疫应答。而大量的研究也表明,HSP中富含符合MHCⅠ分子结合特征的肽段,并被认为是MHCⅠ结合肽的丰富来源。所以许多研究者提出,被MHCⅠ分子结合递呈的 HSP源肽段(HSP-derived peptide)是机体T淋巴细胞识别的重要靶点,这一识别过程使得HSP成为介导机体T细胞免疫的重要分子。如Zugel等的早期研究发现,将分支杆菌HSP60制成免疫刺激复合物免疫 C57BL/6小鼠,能够活化MHCⅠ类分子H-2Db限制性的具有TCRαβ的 T淋巴细胞,这种T细胞能够在体外裂解经IFN-γ处理的巨噬细胞。但是当用反义寡核苷酸技术使得巨噬细胞中HSP60的表达抑制后,上面的提到的 T细胞则再不能有效裂解不表达HSP60的巨噬细胞〔7〕。这一研究充分的表明,HSP不但能够介导活化T淋巴细胞,而且其自身的某些肽段也成为被免疫系统递呈和识别的靶位。人们由此发现细菌HSP引发的针对细菌HSP的免疫应答能够与细胞自身的HSP发生交叉反应,从而造成自身免疫疾病的发生。与之相似,人们也发现麻疹病毒感染细胞能够使细胞HSP90的表达明显上调,这些蛋白能够被MHCⅠ类分子HLA-A*0201递呈,由此可激活体内T淋巴细胞。而且发现这种活化的T淋巴细胞能够与正常细胞上与MHCⅠ类分子结合的HSP90相关肽段结合而杀伤正常细胞,从而作者认为这可能是麻疹病毒致病机制的一个重要方面。此外,HSP在癌症免疫中也起到同样的作用,例如,Azuma等的研究表明,结肠癌细胞上被 HLA-B46递呈的HSC70(heat shock cognate protein 70)的106-114和233-241两个肽段能够活化肿瘤浸融性T淋巴细胞,这种被活化的T淋巴细胞能够对肿瘤细胞产生杀伤作用〔8〕。

总之,机体在受到细菌、病毒等感染以及在癌症发生过程中,HSP被诱导大量表达,这些HSP在被抗原递呈细胞有效递呈的基础上介导T淋巴细胞的活化。这些活化的细胞成为机体清除感染、抵御癌症的主要力量。

3.2 HSP与机体固有免疫应答 在20世纪末的一些研究普遍表明,HSP能够刺激机体的单核巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤性细胞等固有免疫细胞活化,介导免疫细胞产生相关细胞因子产生和表面标志变化,参与免疫细胞的成熟分化和免疫学信号途径优化等过程〔9〕。

科学家通过对TLRs遗传互补系统的研究发现,HSP70需要通过TLR4或TLR2的介导来履行其固有免疫刺激活性。但 Yokota等的研究表明HSP70和HSP60都可以通过TLR4而非TLR2活化NF-κB诱导单核细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因-α(TNF-α),并且这种诱导作用可以被其相应的抗体加强〔10〕。然而,依然有学者认为TLR2和TLR4共同参与了HSP70介导的NF-κB的活化。HSP70与 TLRs的作用需要 CD14和(或)MD-2辅助蛋白的帮助。在没有CD14的条件下HSP70不能诱导NF-κB的活化 。CD14的单克隆抗体可以抑制HSP70诱导细胞产生白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子。MD-2也是一个很重要的辅助蛋白.它和TLR4组成二聚体帮助TLR4对配体的识别。TLRs和相应的配体结合后,主要通过My D88依赖性途径最终引起NF-κB的活化。My D88缺陷型293细胞在受到HSP70和 LPS刺激时不能活化NF-κB。

但是,长期以来人们对于HSP刺激机体产生固有免疫应答的能力还存在争议,因为很多学者怀疑在从细菌细胞中提取HSP作为固有免疫免疫原时其中有LPS的污染,由于 LPS是一种有效的病原相关分子模式,它能够高效地刺激固有免疫细胞的活化。如Gao等报道高度纯化的重组人 HSP70(含LPS 1.4 pg/μg)不能诱导小鼠巨噬细胞产生TNF-α,而 HSP70(含 LPS 0.2 ng/μg)却能够诱导TNT-α的生成〔11〕。这就需相关实验设置更多合理的实验对照。后来的研究者们发现多粘菌素B(polymyxin B,PmB)能够抑制LPS的生物学活性,然而用PmB处理从细胞中提取的HSP并不影响HSP刺激固有免疫细胞活化的效应,从而说明HSP具有固有免疫刺激活性。尽管如此,还有很多学者怀疑在PmB抑制LPS的试验中,HSP所具有的分子伴侣作用可能会庇护LPS免受PmB的作用。最近,随着人们对于机固有免疫应答机制更加深入的认识,上述这一富有争议的问题有望在分子水平得到解释。如有研究发现,HSP70诱导固有免疫细胞产生TNF-α的效应能被一细胞内钙离子螯合剂所阻断,但LPS的作用并不受这一螯合剂的影响。这就说明了无论 LPS存在与否,HSP确实有刺激固有免疫细胞活化的功能。

4 HSP在疫苗研制中的应用

4.1 在肿瘤疫苗中的应用 在20世纪后期,科学家们对肿瘤抗原进行了广泛研究,发现并鉴定了许多肿瘤抗原,并一直期望能够利用这些抗原制作成疫苗用于肿瘤的预防和治疗。虽然其中的问题重大,但是近些年来该研究领域中不断取得的突破性进展使得人们看到了成功研制肿瘤疫苗的希望。其中HSP用于肿瘤疫苗的设计是其中的典型代表。早在1993年,科学家在研究能提供保护力的肿瘤细胞的免疫原性组分时发现,从这些细胞中提取得到的HSP70能够刺激小鼠产生针对同种肿瘤的免疫应答。后续研究进一步证实,HSP70并不能单独作为抗肿瘤免疫原,而是其结合了另外一些低分子量抗原肽共同发挥作用。从此以后,HSP在肿瘤免疫中的作用及其用于肿瘤预防治疗的价值逐渐受到重视。从目前的研究来看,从肿瘤细胞分离的HSP可作为有效的肿瘤疫苗,这些 HSP包括胞质中的HSP70、HSP90、HSP110以及内质网中的 grp941/gp96、grp170等。此外,有研究表明,富含 HSP的肿瘤细胞裂解物也可作为有效的肿瘤疫苗〔12〕。目前,至少有10多种此种类型的疫苗已经进行了或正在进行着 Ⅰ/Ⅱ期临床试验,对这种源于肿瘤HSP70或gp96/grp94疫苗的安全性、效力及临床价值等方面进行评价。

但是,上述制备疫苗的方法有着很大的局限性,如此方法耗时、并需要从患者机体中获得相当数量的肿瘤组织等都是限制这种疫苗广泛开发的因素。因此,科学家一直探索应用当前的生物技术方法在体外制备类似的HSP负载肿瘤特异性抗原的复合物用于肿瘤疫苗的研制。如Suzue等将分支杆菌的HSP70与卵白蛋白(ovalbumin)融合后免疫小鼠,发现该蛋白能够刺激机体产生卵白蛋白特异性的CTL免疫应答,这种应答能够保护小鼠抵御表达卵白蛋白的黑色素瘤的攻击〔13〕。同样地,有些学者将HSP110与乳腺癌特异性抗原HER-2/neu或黑色素瘤抗原gp100组成复合体免疫小鼠也能够给动物提供强的抗肿瘤免疫。而且,很多关于肿瘤DNA疫苗的研究都将HSP编码基因与肿瘤特异性抗原

基因组合呈嵌合基因后与适当的载体重组后免疫肿瘤模型动物,普遍取得了良好的效果。如Chen等将分支杆菌的HSP70基因与人乳头瘤病毒16型的E7基因融合构建DNA疫苗,结果显示该疫苗能够刺激机体CD8+T细胞免疫应答,从而其显示了很好抗肿瘤作用〔14〕。此外,人们将表达HSP70的腺病毒进行肿瘤内注射,结果发现该病毒能够起到明显的肿瘤溶解作用。近些年来,很多研究报道用肿瘤来源HSP致敏树突状细胞后,将致敏的树突状细胞过继转移到肿瘤患者体内可以起到抗肿瘤的作用,而且显示了良好的治疗效果。科学家们普遍认为,这种疫苗对于许多肿瘤的治疗,特别是损伤患者免疫系统中树突状细胞功能的肿瘤有很好的应用治疗价值。再者,人们还发现某些肿瘤细胞在经过人为的体外操作,使其过表达HSP时,它的致肿瘤能力明显下降,但当将这些过表达HSP的肿瘤细胞免疫机体后,机体能够产生有效地抵抗同种肿瘤的侵染。这些研究为治疗性肿瘤疫苗的开发提供了新的思路〔15〕。

4.2 HSP在传染病新型疫苗研制中的应用 HSP最早是应用于肿瘤疫苗的研制中的,但近些年来,疫苗学家们逐渐将其应用于传染病疫苗的研制中,并取得了一系列可喜的成果。如Koets等在认识到牛副结核病原鸟分支杆菌(Mycobacterium avium spp.paratuberculosis,MAP)的HSP是细菌介导宿主体液免疫和细胞免疫的主要抗原分子的基础上,将分支杆菌的HSP70与佐剂溴化二甲基双十八烷基铵(dimethyl dioctadecyl ammonium bromide,DDA)配伍制成亚单位疫苗,免疫动物后取得良好的免疫效果。该疫苗不但可以保护健康动物抵抗分支杆菌的感染,而且可以起到治疗的效果,它能够减轻亚临床感染动物持续排出病原的状况〔16〕。此外,HSP在病毒性疾病疫苗研制方面也得到了广泛的应用。Suzue等将HIV病毒的p24蛋白与结核分枝杆菌的HSP进行串联表达,表达的蛋白在无佐剂的情况下免疫小鼠,该蛋白能够诱导机体产生高水平的抗p24蛋白的抗体,并且该抗体水平可持续近一年时间〔17〕。该项研究使人们相信,HSP可作为病原体抗原肽段或抗原表位的辅助蛋白分子(或载体)起到诱发与促进体液免疫和细胞免疫的免疫佐剂作用。近些年来,有关HSP应用于病毒疫苗研制的报道不断涌现,如HSP已用于HIV、HBV、汉坦病毒、日本脑炎病毒、口蹄疫病毒、HPV、猪呼吸与繁殖障碍综合症等〔18-21〕。疫苗的形式涉及亚单位疫苗、表位肽疫苗、表位核酸疫苗等。总体上看来,HSP不但能够增加疫苗诱导体液免疫的能力,更重要的是它能够在很大程度上促进疫苗刺激机体产生细胞免疫。

5 结 语

HSP是一组在生物体中高度保守并具有重要生理功能的蛋白质分子家族。在过去的研究中,人们对其所具有的分子伴侣作用相关的生物学功能进行了深入研究。与此同时,大量的研究已经充分证明,HSP还具有广泛的免疫学生物活性。主要体现在以下几个方面:(1)HSP介导APC对其自身或与其偶联的外源性抗原肽段通过MHCⅠ类分子进行递呈或交叉递呈,进而介导CD8+T淋巴细胞免疫应答;(2)HSP作为细胞在免疫应急条件下的细胞内危险信号,可将机体受到外源微生物感染、癌变等的信号传递给免疫系统,使免疫系统能够做出相应的应答反应。(3)HSP能够直接与 TLR相互作用介导固有免疫应答,或与LPS等病原相关分子模式(pathogen associated molecular patternes,PAMPs)结合,从而调节PAMP诱导的 TLR等模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)活化信号通路。基于以上的这些发现,科学家们已经开始普遍关注HSP与机体肿瘤发生和控制、自身免疫耐受形成及自身免疫疾病发生等重大免疫学问题的关系。此外,人们也积极地将HSP用于抗细菌、病毒、寄生虫和肿瘤新型疫苗的研制当中,并取得了一系列可喜的成果。特别值得一提的是,目前许多病毒性疾病疫苗和肿瘤疫苗之所以不能够提供完全的保护力,是因为其不能提供有效的细胞免疫。而HSP参与了抗原交叉递呈的过程,这就给这一问题的解决带来了很大的希望。尽管如此,我们也应看到,截至目前还没有一种基于HSP的有效疫苗问世。一方面是因为我们对HSP介导的免疫学效应的具体机制还不清楚,很多方面在科学界还存在争议;另一方面,我们将HSP用于疫苗研制的探索还很不够。所以,积极开展HSP相关免疫学效应的相关研究,对于我们深入认识机体免疫应答机制和防治重大人畜传染性疾病及肿瘤疾病意义重大。

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