芍药苷下调PC12细胞酸敏感离子通道1a的表达拮抗酸诱导的钙内流

曹碧茵，孙 雪，杨亚萍，，孔 岩，刘春风，

(1.苏州大学附属第二医院神经内科，江苏苏州 215004;2.苏州大学神经科学研究所，江苏苏州 215123)

CAO Bi-yin1，SUN Xue1，YANG Ya-ping1，2，KONG Yan2，LIU Chun-feng1，2

(1.Dept of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215004，China;2.Institute of Neuroscience，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China)

酸敏感离子通道(acid sensing ion channels，ASICs)是一类能被细胞外H+激活的阳离子通道，其中的ASIC1a亚基能介导钙的内流，参与了脑缺血缺氧、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等神经系统疾病的病理过程［1］。阻断ASIC1a的激活或降低其表达均可起到一定的神经保护作用［2］，为神经退行性疾病提供了一个新的防治策略。本研究在PC12细胞上观察酸性培养液对细胞内游离钙离子浓度、ASIC1a转录及表达的影响，并给予芍药苷(Paeoniflorin，PF)进行干预，ASICs的非特异性阻断剂阿米洛利(amiloride，Ami)作为阳性对照药物，以探讨PF对ASIC1a的表达是否具有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 芍药苷标准品购自中国药品生物制品检定所;Amiloride、Fluo-3/Am购自Sigma公司;RPMI 1640培养基、新生牛血清购自Gibco公司;定量RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;兔抗ASIC1抗体购自Alpha Diagnostic International公司;小鼠抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗体、ECL发光剂等均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 细胞培养及处理 PC12细胞用RPMI 1640完全培养基(含10%新生牛血清)进行常规培养。实验前1 d接种于6孔培养板，稳定生长24 h，将细胞分为4组:正常对照组(control)更换为pH 7.2的新鲜培养基;酸处理组(pH 6.0)更换为pH 6.0的酸性培养基;Ami组和PF组则分别在酸性培养基内加入 Ami(100 μmol·L－1)或 PF(50 μmol·L－1)，继续培养24 h。

1.3 流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化 收集细胞，预冷无钙磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，调整细胞浓度为1×109·L－1。取 200 μl细胞悬液，加入终浓度为 10 μmol·L－1的 Fluo-3/Am，37℃ 孵育 30 min，漂洗后重悬于 200 μl PBS中，上流式细胞仪检测，激发波长488 nm，每组取10 000个细胞的荧光强度值的平均值为每份标本的测定值。

1.4 定量RT-PCR检测ASIC1a mRNA转录水平 提取细胞总RNA，按试剂盒说明书进行RT反应，得cDNA模板。根据目的基因在GenBank中的已知序列，由宝生物工程(大连)有限公司设计合成引物。ASIC1a引物:上游5′-GCCCACATCTTCTCCTAT-3′，下游 5′-CTTGGTGACGTGGTGATA-3′;β-actin 引物:上游 5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游 5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。两步法进行 PCR反应，同时测定各样本的溶解曲线。每样本做3个复管，求出各样本平均 Ct(cycle threshold)值，再按2－△△Ct进行相对定量分析，求出各组细胞ASIC1a mRNA相对于正常对照组的Fold值。将上述过程重复3次，进行统计学分析。

1.5 Western blot检测ASIC1a的蛋白表达 收集细胞，提取细胞总蛋白。经浓度测定及变性后，取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，将胶上蛋白转移至PVDF膜，封闭后分别加入ASIC1(1∶1 000)和 β-actin(1∶1 000)抗体4℃孵育过夜。次日TBST洗3次，加入HRP标记的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h，ECL发光法显影于X光胶片上。免疫印迹条带密度=面积×灰度，每个样本的条带密度与同一样本的β-actin进行比较求出比值，再计算出相对于正常对照组的Fold值。将整个实验重复3次，进行统计学分析。

2 结果

2.1 各组细胞内游离钙离子浓度的变化 pH 6.0组Fluo-3的平均荧光强度为4.55±0.45，高于 control组(2.44±0.03，P=0.015);与pH 6.0组相比，Ami组和PF组的荧光强度降低(3.15±0.38)s(P=0.003)、(3.01±0.18)s(P=0.002)，但是control组、Ami组和PF组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组细胞ASIC1a mRNA转录水平的变化 pH 6.0组ASIC1a mRNA的转录水平升高至control组的(3.36±1.30)倍，差异有统计学意义(P=0.035)。与pH 6.0组相比，Ami组和 PF组 ASIC1a mRNA转录水平均明显降低(0.63±0.48)s(P=0.007)、(1.19±0.31)s(P=0.018)，但是control组、Ami组和PF组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组细胞ASIC1a蛋白表达的改变 pH 6.0组ASIC1a的蛋白表达水平升高到control组的(1.29±0.11)倍，差异有统计学意义(P=0.047)。与pH 6.0组相比，Ami组和PF组ASIC1a的表达降低(0.58±0.16)s(P=0.004)、(0.70±0.23)s(P=0.010)，但是 control组、Ami组和 PF组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

ASIC1a亚基在中枢神经系统广泛表达，可直接或间接促进钙离子内流，引起随之发生的钙超载和细胞凋亡［2］。ASICs与PD、HD等神经系统疾病的关系日益得到关注，阻断ASIC1a的通道功能或利用基因敲除技术减少ASIC1a的蛋白表达均能起到治疗作用［3，4］。寻找以ASICs为靶点的药物，设计和改造具有高选择性和高活性的ASICs抑制剂成为神经生物学和药物化学的研究热点之一。

PF是芍药的主要活性成分，抑制炎症反应［5，6］、减少钙内流、清除活性氧［7］、拮抗神经细胞的受损死亡，在 PD［8］、脑缺血缺氧［9］、癫痫等多种病理模型中发挥了神经保护作用，而这些病理模型均表现出局部的组织酸化现象，并发现了ASICs的异常激活。因此，ASICs可能是PF发挥神经保护作用的潜在靶点。

本研究利用pH 6.0的酸性培养基特异性地激活ASIC1a亚基，导致PC12细胞内游离钙离子升高，ASIC1a的表达水平明显上调。PF不但降低了细胞内游离钙离子浓度，还使ASIC1a的转录和表达均维持在正常状态，其药效与Ami相比没有明显差异，并且有效浓度低于Ami，因此PF有可能是ASIC1a的天然抑制剂。

(致谢:苏州大学放射医学与公共卫生学院、江苏省放射医学与防护重点实验室为本研究提供了良好的科研条件和大力支持。)

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