人 C-反应蛋白的分离纯化及初步应用

黄国团 王丽兰 蔡豪斌, 秦新民 阳艳华 贝鸿池 张 旋

1.桂林英美特生物技术研究所,广西 桂林 540001;2.桂林医学院,广西 桂林 541004;3.广西师范大学,广西 桂林 541004

C-反应蛋白 (CRP)是一种非常重要的急性时相反应蛋白,主要由肝脏合成。正常人群的 CRP 浓度很低,新生儿为 0.1～0.6mg/L,成年人为 0.4～5.2mg/L。炎症、感染和组织损伤等发生后,CRP 浓度会迅速升高,病情转好又迅速降低至正常水平,升高的幅度与病情的严重程度呈正相关[1]。检测CRP 对于许多疾病的筛查、监测与疗效评估具有重要价值。临床应用中多采用免疫透射比浊法测定CRP,能够实现自动化分析,使用方便快捷。

CRP 受到越来越多的关注,获得CRP 对于进行生产研究具有重要意义。商品 CRP 具有较好的性能,但是价格昂贵。拟建立一种简单经济实用的分离纯化人CRP 的方法,获得高纯度的 CRP,并进行初步应用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

CNBr-activated Sepharose 4B(GE Healthcare),CRP(Leebio),PEG6000(SHBC),CRPMcAb(桂林英美特生物技术研究所),全自动生化分析仪 (日立 7080)。

1.2 方法

1.2.1 CRP 的分离纯化

1.2.1.1 硫酸铵沉淀总蛋白

从医院收集临床血清样本 (CRP＞100mg/L),用 80%饱和度的硫酸铵沉淀总蛋白,4℃沉淀过夜;于 4℃、8000rpm 离心 30min,用基础缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl,pH 7.8)溶解沉淀,充分透析除去硫酸铵。

1.2.1.2 初步纯化CRP

取适量活化好的 DEAE 填料按常规方法装柱,用基础缓冲液平衡。经过预处理的样品上样,通过改变离子强度进行梯度洗脱 (洗脱液中 NaCl 浓度分别为 80、120、250mmol/L),按 A280收集洗脱液,进行 SDS-PAGE 电泳和 Western Blotting 检测 。

1.2.1.3 亲和层析精制纯化CRP

取 1gCNBr-activated Sepharose 4B 填料用 1mmol/L HCl进行溶胀及洗涤,加入 30mg 用偶联缓冲液 (100mmol/L NaHCO3,500mmol/L NaCl,pH 8.3)充分透析的 CRP McAb,4℃摇摆偶联过夜;用 1mol/L 的乙醇胺封闭 2h;以缓冲液A(100mmol/L NaAc,500mmol/L NaCl,pH 4.0)与缓冲液 B(100mmol/L Tris-HCl,500mmol/L NaCl,pH 8.0)交替洗涤 3次,装柱。初步纯化的目的蛋白用结合缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl,120mmol/L NaCl,pH 7.8)充分透析后,上样,以洗脱液 (100mmol/L NaAc,500mmol/L NaCl,pH 2.9)洗脱,按 A 280收集洗脱液,进行检测[2]。

1.2.2 CRP 多克隆抗体的制备纯化

选一只成年健康山羊作为免疫动物,以自提高纯度CRP 为抗原,按常规方法制备多克隆抗体,采用正辛酸-硫酸铵法进行纯化,并进行检测。

1.2.3 CRP 免疫透射比浊定量检测方法的建立及评价

用制备的多克隆抗体建立CRP 免疫透射比浊定量检测方法,并进行评价[3]。采用两点终点法,主波长为 340nm,反应温度为 37℃,S、R1、R 2的进样体积分别为 10、 180、20μL,分析点为 16、31,免疫非线性多点定标 (测定均在日立 7080全自动生化分析仪上完成)。

2 结果

2.1 CRP的检测结果

DEAE 离子交换层析初步分离纯化除去了大部分杂蛋白,但目的蛋白纯度不高;通过亲和层析进一步精制纯化取得了很好的效果。SDS-PAGE 结果显示最终的纯化产物中出现相对分子质量约为 23000的主带 (图 1),凝胶扫描显示其相对纯度为 93.1%;Western Blotting 结果显示其能与 CRP 单克隆抗体发生特异性结合 (图 2),证实为 CRP,且与商品 CRP 有很好的可比性。

2.2 CRP多克隆抗体的检测结果

SDS-PAGE 结果表明纯化后的CRP 多克隆抗体纯度高(图 3);Western Blotting 结果显示其能与 CRP 发生特异性结合 (图 4);其总蛋白含量为 36.3mg/mL,ELISA 效价为1：256000。

2.3 CRP免疫透射比浊定量检测方法的建立及评价结果

2.3.1 试剂主要成份的确定

以 40mmol/L,pH 7.5的磷酸盐 (含 100mmol/L NaCl)为基础缓冲液,R 1中PEG 6000的最佳浓度为 40g/L;R2中CRP 多克隆抗体的最佳浓度为 10mg/mL。

2.3.2 线性范围

将高浓度的 CRP 样本稀释形成不同浓度的样本,均重复测定 3次。结果表明 CRP 浓度在 3.1～150.0mg/L 范围内线性良好 (y=0.0013x+0.0038,R2=0.9948)。

2.3.3 检出限

测定 CRP 浓度为 0.0mg/L 的样本,连续重复测定 20次,得出检出限为 0.4mg/L(DL=K'SD/k,K'=3)。2.3.4 重复性

取不同浓度的样本,批内重复性试验连续重复测定 20次;批间重复性试验每天测定 1次,连续 20 d。批内、批间不精密度水平﹤ 5%,表明具有良好的重复性。

2.3.5 稳定性

将试剂 (R 1、R2)置于 37℃,分别于第 1d、3d、5d、7d 取出用于测定。5d 内不精密水平﹤ 10%,表明具有良好的稳定性。

2.3.6 比对试验

分别用自制试剂与德国德赛试剂测定临床样本 (n=40)。其回归方程为 y=1.0325x+0.6502,R 2=0.9997,经t 检验得P＞0.05,表明两者具有很好的可比性。

3 讨论

从人或动物的组织、体液或细胞中分离纯化所获得的蛋白,与生理状态下的蛋白最为接近,研究应用价值比较大。血清中成份比较复杂,采用单一方法难以取得很好的效果,应根据 CRP 性质特点综合运用不同方法进行分离纯化。如果直接采用亲和层析进行分离纯化,洗脱难度大,分离纯化效果有限,且会降低亲和层析柱的使用寿命。实验运用饱和硫酸铵对样本进行预处理和 DEAE 离子交换层析进行初步分离纯化,除去了大部分杂蛋白,在此基础上运用制备 CRP 单克隆抗体亲和层析柱进行精制纯化。分离纯化获得高纯度的 CRP,与商品CRP 有很好的可比性。成功建立了一种分离纯化人CRP 的方法,能够以较低成本大量获得高性能的 CRP,有利于进行生产研究。

考虑到反应的敏感性,试剂成本,技术要求等因素,免疫透射比浊试剂中多使用多克隆抗体而不是单克隆抗体。运用自提高纯度的 CRP 为抗原,可持续大量制备出高质量的CRP 多克隆抗体;并初步建立起CRP 免疫透射比浊法,各方面性能指标均比较好,为研制 CRP 免疫透射比浊试剂奠定了基础。

[1]Rosalki SB.C-reactive protein[J].Int J Clin Pract,2001,55(4)：269-270.

[2]马宏伟,赵卫国,潘柏申.亲和层析法分离纯化人心肌肌钙蛋白 I[J].检验医学,2007,22(3)：304-307.

[3]Bence LM,Addie DD,Eckersall PD.An immunoturbidimetric assay for rapid quantitative measurementof feline alpha-1-acid glycoprotein in serum and peritoneal fluid[J].Vet Clin Pathol,2005,34(4)：335-341.