牛膝应用于大鼠同种异体肢体移植抗排斥反应的研究

冯磊 张震宇 谷文光

(1.齐齐哈尔市第一医院 黑龙江齐齐哈尔 161000; 2.哈尔滨医科大学第一附属医院 黑龙江哈尔滨 150000)

牛膝具有明显的免疫抑制作用,已被广泛认可,但其发挥免疫抑制功能的作用机制,并为完全明了,有大量实验研究表明,牛膝抗排斥反应的作用途径是多方面、多角度的。在免疫细胞水平的抑制作用,可明显抑制T、B淋巴细胞的转运功能,对巨噬细胞和NK细胞都有一定抑制作用。在免疫分子水平的抑制作用,通过抑制IL～2、IL～6的分泌,从而对细胞毒T细胞的产生和成熟形成有一定的抑制作用,影响其对靶细胞的杀伤能力。其他途径,可以抑制细胞毒T淋巴细胞的功能,减弱其释放穿孔素和颗粒酶B的表达能力,从而影响CTL细胞对靶细胞的杀伤。

1 资料与方法

1.1 一般资料

受供者分别为10～12周龄清洁及纯系健康雄性Wistar大鼠、SD大鼠,体重200～250g,购自哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心和北京维通利华公司,实验动物均在清洁级条件下喂养。

1.2 实验方法

牛膝水提取物的制备由哈尔滨医科大学附属第一医院药剂局协助完成。将牛膝粉碎后加双蒸水浸泡,煮沸3次,合并3次药液放入4℃冰箱中过夜,以3000r/min 离心30min取上清液用双蒸水稀释。

1.3 实验分组

雄性Wistar大鼠及雄性SD大鼠各27只。随机分成3组,每组各9只。SD大鼠为受体,Wistar大鼠为供体。实验分为3组,每组9只。移植肢体术后2d内死亡的认为发生手术并发症,不进入实验观察,另行手术补充。A组(牛膝组):将牛膝水化稀释为0.25g/mL,术后术后当日起每隔1d天灌服1次,剂量为5mg/kg。B组(对照组):术后不用免疫抑制剂,仅应用生理盐水10mL/kg·d-1灌服。C组(环孢素A,CsA)组:术后将CsA用生理盐水稀释为1mg/mL,术后当日起每隔1d灌服1次,剂量为5mg/kg。

1.4 检测指标

1.4.1 一般指标 观察项目包括大鼠的活跃程度、饮食、大小便、生命体征、皮肤、体毛、伤口有无分泌物、红肿;移植物的血循、颜色、温度、肿胀程度、体毛的变化、皮肤水疱、渗出、溃疡、糜烂、焦痂、足趾变黑坏死等,详细记录各种变化的时间及情况。

1.4.2 急性排斥反应的观测 根据异体移植肢体的血运变化和皮肤表现,观察各组移植肢体急性排斥反应的发生时间和移植肢体存活时间,其中急性排斥反应的发生时间严格限定在移植肢体皮肤出现红斑水肿持续24h,移植肢体坏死标准为皮肤脱落或出现干性坏疽。

1.4.3 移植肢体组织的光镜标本制备及观察 于术后1、3、5、7d切取异体移植肢体包括皮肤、胫前肌、骨、坐骨神经、胫前血管的组织块,消毒缝合切口。用10%甲醛固定,常规方法制备样本。

2 病理学诊断和分级

并根据Lee和Buttermeyer推荐的移植物排斥反应标准进行分级0级为无排斥,各组织正常,无炎性细胞浸润;I级为轻度排斥,血管周围及骨骼肌间质内局灶性炎性细胞浸润,皮肤基底层细胞空泡化;II级为中度排斥,血管周围及骨骼肌间质内多灶性炎性细胞浸润,皮肤上基底层细胞大泡形成;III级为重度排斥,弥漫性多类型炎性细胞浸润,伴有各组织明显的出血、水肿、脉管炎、坏死或纤维化。因为皮肤的排斥反应最强,所以本实验统计每组皮肤排斥反应的病理学分级平均值。CD4+、CD8+细胞检测术后对各组模型行鼠尾取血,用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群中CD4+、CD8+细胞的百分率及CD4+/CD8+的比值。

3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析,进一步多重比较采用LSD-t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

4 结果

大鼠一般于手术后逐渐清醒,起初精神状况较差,但可以饮水、行走、恢复大小便,术后当日基本上可以进食。1d后宿主的精神状况、饮食、大小便、生命体征基本恢复正常。

通过术后连续观察发现,A、B组大鼠术后1～2d移植肢体皮温较健侧肢体稍高,移植物肿胀较轻,血运良好。术后3～4d开始,移植物开始肿胀,先是移植物的上端和足背部,然后迅速加重和扩展,5～6d左右皮肤变湿,7～8d左右肢体毛发开始脱落,皮肤出现红斑并伴糜烂以大腿的内上侧出现最早,9～13d整个移植物变黑坏死。C组大鼠术后移植肢体也轻度肿胀,于术后8～9d天肿胀开始明显,最终于14～19d移植物变黑坏死。A组排斥反应时间(9.62±2.37),肢体平均存活时间（16.11±1.72）;B组排斥反应时间(7.13±1.37),肢体平均存活时间(11.14±1.31);C组排斥反应时间(13.71±2.48),肢体平均存活时间(21.32±1.53)。

5 讨论

同种异体移植排斥反应的本质就是免疫应答过程,都要经过抗原识别、免疫细胞活化分化和效应阶段[1]。有结果显示,同种异体移植排斥反应和常规免疫应答的不同之处主要在于抗原识别和效应阶段。同种异体组织器官移植后,发生急性排斥反应时CD4+T细胞升高,CD8+细胞下降及CD4+/CD8+的比值升高。本实验应用牛膝后,CD4+、CD4+/CD8+的比值明显降低,CD8+明显增高,有延长移植物存活时间和动物模型存活时间的作用,有力的证实了牛膝具有明显抑制排斥反应的作用。综上所述,大量实验已证明牛膝在抗排斥反应有明显的作用,但其具体明确的抑制途径和副作用,还需要进一步的实验研究证实,尽管需要解决的问题不少,但我们相信,随着各种相关研究的深入,中药免疫抑制剂的基础研究,以及未来的临床应用将会有广阔的前景,因此,随着实验技术的提高,中药免疫抑制剂作用机制会得到充分的揭示。相信不久的将来中药免疫抑制剂在临床的应用将造福于人类。

[1]陈宗锴,李电东.牛膝多糖的免疫调节作用[J].药学学报,1997,32(12):881～887.