阻断内毒素信号转导治疗内毒素血症的研究进展

张 馨, 汪茂荣

内毒素(endotoxin)是由革兰阴性菌所产生、存在于菌体内的一类毒素,是菌体细胞壁的组成成分。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性细菌内毒素的重要成分,是最经典、最初确认的致病因子,是迄今为止研究最深入的病原体相关模式分子(pathogen-associated pattern molecular,PAPM)。内毒素有多种生物活性,进入人体血液可造成内毒素血症,可引起多种病理生理变化如发热、休克、弥散性血管内凝血和粒细胞减少等,可造成严重后果如呼吸窘迫综合征、急性肾衰竭,甚至多器官功能衰竭等多种疾病,最终可因内毒素休克死亡。多年来,关于LPS信号转导机制研究显示,LPS在细胞外在LPS结合蛋白(LPS-binding protein,LBP)、CD14、髓样分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)协助下导致Toll样受体4(Toll-like receptor 4,T LR4)受体寡聚化激活,将LPS刺激信号向细胞内转导,通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖和非MyD88依赖的两条途径触发一系列的信号级联反应,诱导促炎细胞因子的表达,最后启动炎症反应。TLR4信号转导通路在这一过程中起着极其重要的作用,成为治疗内毒素血症研究中的重要靶点。

目前,对内毒素血症尚缺乏特效药物,一旦炎症反应发生,要打断级联的病理反应过程,就需要采取多位点的药物治疗。复合药物的疗效明显优于单一药物的治疗,临床上多采用综合治疗。主要治疗手段有：①抗感染、减少内毒素的产生和吸收。包括抗生素的使用、LPS合成抑制剂的应用、选择性肠道清洁疗法清洁肠道、改善肠道内环境。②清除血液中的内毒素。包括血浆净化技术、杀菌/通透性增加蛋白、抗菌蛋白、抗菌多肽、鲎抗LPS因子等。③阻断内毒素的信号转导通路或减轻其产生的炎症效应。④加强支持治疗,增强机体对LPS的抵抗力。包括使用免疫调节剂和支持治疗、抗氧化剂的应用、中药制剂等。目前研究主要集中于对内毒素受体、受体信号转导途径及各途径间的相互关系上,在此研究基础上,阻断内毒素的信号转导通路可能成为治疗内毒素血症最有效的手段。本文就近年来阻断内毒素的信号转导通路治疗内毒素血症相关研究进展综述如下。

一、内毒素抗体

由于脂质A的基本骨架在不同种属的细菌间基本一致,因此,利用 LPS的抗原特异性研制抗LPS抗体是抗LPS治疗的重要途径。抗LPS抗体能中和内毒素的实验研究结果,被认为可给内毒素血症的治疗带来新的契机。特别是当抗LPS抗体研制和生产技术不断进步,由多克隆抗体到单克隆抗体产品的转化,曾经进入临床试验的有美国研制的鼠源性IgM单抗 E5和人源性的脂质 A单抗HA-IA。Manthous等[1]曾用 LPS McAbHA-IA治疗1例无明确感染灶而出现低血压休克的暴发性肝衰竭患者,结果肝功能改善,病情好转。但抗体存在有菌型抗原的特异性,在后期的临床试验中由于其疗效未能被证实而自然终止[2]。1993年 Akita等[3]和Warr等[4]报道应用LPS免疫产蛋母鸡,可以获得大量类似于单克隆抗体的鸡蛋黄抗体IgY。IgY本质上是一种IgG,是鸡血液中的IgG被选择性的转移到卵黄中,而且是卵黄中的唯一免疫球蛋白类。IgY对酸、酶、温度具有较高的稳定性,且其被胃蛋白酶消化后所得的Fab′片段稳定性和活性更强,为通过口服给药、中和肠道内LPS提供了可能。目前,国内外抗LPS鸡蛋黄IgY抗体的制备和药理研究仍在进行中。

二、LPS受体拮抗剂

(一)E5531[5-8]阻断内毒素产生生物学效应的最有效的环节应是阻断内毒素与其受体结合。在过去的16年中,人们热衷研究合成多种不同的脂质A结构类似物,最终有2代合成类似物进入了临床试验阶段。第一代脂质A类似物是E5531,一种在红英膜细菌(Rhodobacter capsulatus)脂质A结构基础上合成的类似物不但本身无毒性,而且可抑制其他革兰阴性菌诱导产生细胞因子。体外实验表明,E5531可抑制内毒素刺激鼠腹腔巨噬细胞,人血单核细胞 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及 IL-10、一氧化氮(NO)的产生。E5531拮抗内毒素作用的机制在于：E5531能竞争性地与内毒素结合蛋白 LBP结合,进而抑制内毒素与CD14受体及T LR4结合,从而阻断内毒素的信号转导所引起的细胞活性。2000年E5531进入I期临床试验,证实E5531可改善内毒素引起的头痛、恶心、发热、心动过速、血压下降等症状和体征,降低受试者血中 TNF-α、IL-6、C反应蛋白及白细胞计数。后E5531进入Ⅱ期临床试验阶段,用于LPS引起的发热和感染性休克的治疗。但研究表明,E5531活性呈时间依赖性降低,可能是由于E5531与血浆脂蛋白相互作用的原因,限制了其临床应用。

(二)E5564[9-14]E5564来源于球形红螺菌(R phaeroides),被称为第二代 LPS拮抗剂,其结构、合成较E5531简单,且比E5531有更高的活性和药理学特性。虽然E5564也像E5531一样会与血浆中脂蛋白结合而失去活性,但比E5531在血浆中保持活性的能力强。Mullarkey等[11]研究表明,E5564的作用机制可能是与T LR4/MD-2复合体结合后阻断内毒素的信号转导,而与血浆中的LBP和可溶性CD14关系不大。最近,Kim等[10]对TLR4/MD-2与E5564相结合的三维结构进行了描述,更证实了这些分子之间的关系。在体外实验,E5564与抗生素联用可使小鼠死亡率比单用抗生素减少60%。E5564的安全性和耐受性也在I期临床试验中得到了证实。除了偶发的静脉炎外,E5564的耐受剂量和时间分别达到了252 mg和72 h以上。研究表明,与E5531相比,E5564对CK的产生具有更强的抑制作用,且能维持一段时间的高剂量活性,可能对临床治疗更有利。2005年Eisai(日本卫材)公司公布了Eritoran(E5564商品名)用于治疗严重败血症的北美Ⅱ期临床试验结果。与安慰剂组相比,特定剂量的Eritoran组总病死率要低6%。Eritoran研究收入的293例患者,随机分为3组：高剂量组(105 mg/d,疗程6 d),低剂量组(45 mg/d,疗程6 d)及安慰剂组。卫材公司指出,该研究的总目标是与安慰剂组相比,在28 d时的总病死率至少低5%。根据PROM(APACHE Ⅱ预期病死率风险)评分,高风险亚组死亡获益最大,其中高剂量组病死率为33.3%,低剂量组为37.9%,安慰剂组为50.9%。与安慰剂相比,高剂量组病死率低 17.6%(P=0.07),低剂量组病死率低13%(P=0.17)。Eritoran的治疗脓毒症Ⅲ期临床试验于2006年6月在北美、南美、欧盟等地区250所单位展开,预期2009年底能获得总结资料。E5564是目前看来的一种具有良好临床应用前景的内毒素受体阻断剂。

(三)CRX-526[15-17]CRX-526是一种化学合成的脂质A类似物,由于其分子中次级脂肪酰基链较短,使其失去了脂质A一样的致炎作用。在2种小鼠结肠炎的模型中观察到,无论在体内或体外,CRX-526可阻断LPS诱导的单核细胞促炎因子的生成、释放。研究显示,用大剂量CRX-526在LPS刺激前预处理人单核细胞,可完全抑制LPS诱导的基因转录。其确切的作用机制尚在研究中。有一种假设,CRX-526可能是通过直接与TLR4受体复合物相结合,从空间上抑制LPS与之结合。

(四)抗CD14抗体 IC14,一种抗人CD14的嵌合单克隆抗体,研究表明其能明显减轻LPS的生物效应,能明显降低LPS引起的发热等临床症状和白细胞升高,抑制TNF-α、IL-6和 IL-10的产生[18]。I期临床试验结果显示IC14可减轻LPS诱导的全身炎症反应,成为阻止严重败血症器官衰竭的可行治疗手段[19]。此外,该试验结果还显示,无论是健康志愿者或严重败血症患者,机体对IC14具有良好的耐受性,不增加继发感染的发生率。与健康人相比,对于严重败血症患者,需要更高剂量的IC14来使mCD14饱和。近期有研究发现联合抑制补体和封闭CD14可有效减轻 LPS诱导的炎症反应[20]。抗CD14抗体能使粒细胞表面的CD14分子饱和,以剂量依赖性抑制LPS诱导的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β释放,但对细菌无清除作用。同时抑制补体可有效减轻炎症反应,但补体的抑制可减少对细菌的清除,故要联合抗生素的应用,协同发挥作用[21]。

(五)抗T LR4抗体[22-24]T LR4蛋白被认为是内毒素激活炎症反应的关键节点,控制T LR4受体的过度活化,可有效抑制其引起的过激炎症反应。封闭TLR4的作用可能很大程度上阻断LPS向胞内传导信号,从而阻断LPS的一系列胞内下游反应。T LR4基因敲除小鼠表现出对LPS的低反应性,LPS不能诱导致死性打击。体外观察发现,抗T LR4抗体可抑制 LPS诱导的核因子-κ B(NF-κ B)活化及炎症介质的产生。目前,已有抗T LR4抗体在细胞、动物模型等试验水平获得较满意的结果。临床上应用尚有待进一步的研究。

三、LPS信号转导干扰分子

这一类因子不能称之为LPS受体拮抗剂,但它们在TLR4细胞内信号转导无论上游还是下游过程中,均拮抗LPS诱导的生物学效应。LPS信号转导干扰分子包括人工合成肽和有机分子。

(一)TAK-242--环己烯衍生物[25-28]2005年,日本Takeda化学实验室应用LPS刺激小鼠巨噬细胞,从其产物中筛选可以抑制炎症介质产生的小分子物质,发现了一种编号5a的前导化合物有此作用,据此设计合成了一系列含氨磺酰基和酯类基团的环己烯衍生物。在抑制炎症介质NO产生的实验中发现其中TAK-242活性最强。TAK-242在体内外均能抑制 LPS介导的 NO、TNF-α、IL-6的产生。体内试验中,在3 mg/kg剂量下,LPS休克小鼠全部成活。TAK-242几乎完全抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞、人U937和P31/FUJ细胞 NO和TNF-α的产生,而具有抗炎作用的IL-8的产生则不受影响。最新的一项研究结果,TAK-242抑制炎症介质的种类很多,除NO、TNF-α、IL-6外还包括 IL-1β、IL-6、巨噬细胞抑制蛋白-2、前列腺素等,小鼠在注射LPS前1 h静脉注射TAK-242,血清内上述炎症介质水平降低,LPS休克小鼠的保护率升高,均呈剂量梯度效应,当剂量达到1 mg/kg时,保护率达100%。研究显示,即使在 LPS处理2 h后注射TAK-242,也能改善肝、肾功能障碍,降低 LPS的致死率,即使在器官已出现功能障碍之后。这一现象的机制尚不明确,有可能是由于其分子量小,能快速分布在组织中并缓解炎症。由于TAK-242能够有效抑制LPS介导的多种细胞因子及炎症介质的产生,并且在 LPS攻击后给药仍能迅速起效,因而自2005年首次报道以后,很快进入临床试验阶段,Ⅰ、Ⅱ期临床试验在日本、美国、欧洲国家进行,然后又迅速在全球范围内展开Ⅲ期临床试验。但由于临床试验中药物在人体的有效性和安全性的不确定以及药物开发的时间、经济成本等问题,日本武田制药公司于2009年2月宣布停止TAK-242的研究。

(二)髓样细胞触发性受体肽[29-30]髓样细胞触发性受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cell-1,TREM-1)是2000年新发现的表达于单核/巨噬细胞等髓样细胞表面的激活型受体,能在细菌或LPS等的刺激下触发髓样细胞产生大量炎性因子,从而在炎症反应的触发和放大过程中起重要作用。多形核白细胞和单核/巨噬细胞的T REM-1表达可被LPS诱导。在 TREM-1序列基础上,Gibot等[30]合成了LP17。培养液中添加LP17或IL-10后,LPS刺激后的促炎细胞因子的生成明显减少。LP17剂量依赖性地抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1β生成,可抑制 TREM-1导致的NF-κ B活化。此外,在给予大鼠致死剂量 LPS前1 h予LP17预处理,将呈剂量依赖性阻止大鼠死亡,且对给予LD100 LPS的大鼠4 h后延迟治疗仍具有显著的保护作用,在其后的 1周内未发生延迟死亡,提示LP17不仅仅延迟始动阶段LPS的致死性,还发挥持续性的保护作用。

(三)贝西沙星(besifloxacin)[31-32]贝西沙星是一种新型氟喹诺酮类抗菌药物,用于眼部感染的局部治疗。最近研究结果提示,贝西沙星显著抑制LPS诱导的 THP-1单核细胞细胞因子生成,这些细胞因子可分为 2组,一组包括GM-CSF、IL-1β、IL-8、IP-10、MCP-1 、MCP-1α,对于这一组细胞因子,莫西沙星和贝西沙星具有相当的抑制作用;另一组包括G-CSF 、IL-1α、IL-1ra、IL-6 、血管内皮生长因子(VEGF),贝西沙星较莫西沙星抑制作用强,而后者在抑制IL-12p40的生成较前者强。这一抑制作用的潜在机制尚不明确,有报道莫西沙星抑制单核细胞和囊性纤维化上皮细胞的MAP激酶和NF-κ B的活化。

(四)复合物K[33-34]近来,Yang等[33]研究发现复合物K,一种人和大鼠肠道细菌对原人参二醇人参皂苷 Rb1、Rb2和 Rc的代谢产物,能调节T LR4介导的炎症应答。MyD88依赖途径的TLR2和T LR4介导的炎症应答均能被复合物K减弱,它作为糖皮质激素受体的激动剂配体发挥其相关功能。

四、其他内毒素拮抗剂

(一)多黏菌素B(polymyxin B,PMB)[35-36]PMB是从多黏杆菌分离得来的一种阳离子环十肽,N端连有一个8碳或9碳的饱和脂肪酸。PMB可直接与携带阴离子的脂质A部分特异性结合,从而抑制脂质A的生物学活性,导致革兰阴性菌外膜通透性增加,因此,PMB兼有中和LPS和抗菌的双重作用。PMB是目前已知的LPS中和能力最强的多肽,往往作为LPS中和试验的金标准。但由于其具有明显的神经毒性和肾毒性,临床使用一直受到限制。人们对PMB的结构进行了改造,在酶的作用下脱去氮端酰基变成不含脂肪酸侧链的九肽,这种改造消除了PMB的毒性,但也失去了杀菌活性,不过仍然保留了与LPS和LipidA特异性结合并中和LPS的生物学活性。

(二)Bac7(1-35)[37-38]Bac7(1-35)是一种人工合成的富含丝胺酸的多肽,来源于牛中性粒细胞中一种具有抗菌作用的蛋白质片段。在体外中和LPS能力与PMB相当,在10 mmol/L浓度下即能完全抑制内毒素的活性,腹腔注射Bac7(1-35)1 mg/kg能显著降低内毒素脓毒症大鼠的死亡率,与60 mg/kg剂量的PMB作用相当,显示出良好的抗LPS活性。

尽管目前的诊断技术、外科治疗手段及新抗生素的研发都有很大进展,严重的革兰阴性细菌感染所致败血症仍会导致很高的病死率(约30%～50%)。分子和细胞生物学技术的发展使内毒素信号转导通路的相关研究取得很大的进展,包括通路中关键分子的结构、作用机制,以及人工合成分子阻断内毒素的信号转导可能成为治疗内毒素血症的有效手段。

[1] Manthous CA,Schmidt GA,Kemp R,et al.Fulminant hepatic failure treated with anti-endotoxin antibody[J].Crit Care Med,1992,20(11)：1617-1619.

[2] Sprung CL,Eidilman LA,Pizov R,et al.Influence of alteration in foregoing life-sustaining treatment practices on a clinical sepsis trial[J].Crit Care Med,1997,25(3)：383-387.

[3] Akita EM,Nakai S.Comparison of four purification methods for the production of immunog lobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain[J].J Immunol M ethords,1993,160(2);207-214.

[4] Warr GW,Magor KE,Higgins DA.IgY：clues to the origins of modern antibodies[J].Immunol T oday,1995,16(8)：392-398.

[5] Means TK,Jones BW,Schromm AB,et al.Differential effects of a Toll-like receptor antagonist on Mycobacterium tuberculosis-induced macrophage responses[J].J Immunol,2001,166(6)：4074-4082.

[6] Lien E,Chow JC,Hawkins LD,et al.A novel sy nthetic acyclic lipid A-like agonist activates cells via lipopolysaccharide/toll-like recepto r 4 signaling pathway[J].J Biol Chem,2001,276(3)：1873-1880.

[7] Bunnell E,Lynn M,Habet K,et al.A lipid A analog,E5531,blicks the endotoxin response in human volunteers with experimental endotoxemia[J].Crit Care Med,2000,28(8)：2713-2719.

[8] Kumar A,Bunnell E,Lynn M,et al.Experimental human endotoxemia is associated with depression of load-independent contractility indices：prevention by the lipid a analogue E5531[J].Chest,2004,126(3)：860-867.

[9] Lynn M,Wong YN,Wheeler JL,et al.Extended in vivo pharmacodynamic activity of E5564 in no rmal volunteers with ex perimental endotoxemia[corrected][J].J Pharmacol Ex p T her,2004,308(1)：175-181.

[10] Kim HM,Park BS,Kim JI,et al.Crystal structure of the T LR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran[J].Cell,2007,130(5)：906-917.

[11] Mullarkey M,Rose JR,Bristol J,et al.Inhibition of endotoxin response by e5564,a novel T oll-like recepto r 4-directed endotoxin antagonist[J].J Pharmacol Exp Ther,2003,304(3)：1093-1102.

[12] Rossignol DP,Wasan KM,Choo E,et al.Safety,pharmacokinetics,pharmacodynamics,and plasma lipoprotein distribution of eritoran(E5564)during continuous intravenous infusion into healthy volunteers[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(9)：3233-3240.

[13] Stierer KA,Hogue CW,Cheung AT.Results of a phase 2 trial of eritoran,a synthetic T LR4 antagonist,in patients with sever sepsis[J].Crit Care Med,2006,34(12)：7-12.

[14] Rossignol DP,Lynn M.TLR4 antagonists for endotoxemia and beyond[J].Curr Opin Investig Drugs,2005,6(5)：496-502.

[15] Johnson DA.Synthetic T LR4-active glycolipids as vaccine adjuvants and stand-alone immunotherapeutics[J].Curr Top Med Chem,2008,8(2)：64-79.

[16] Stover AG,da Silva Correia J,Evans JT,et al.Structure-activity relationship of synthetic Toll-like receptor 4 agonists[J].J Biol Chem,2004,279(6)：4440-4449.

[17] Fort MM,Mozaffarian A,Stover AG,et al.A synthetic TLR4 antagonist has anti-inflammatory effects in two murine models of inflammatory bowel disease[J].J Immunol,2005,174(10)：6416-6423.

[18] Axtelle T,Pribble J.IC14,a CD14 specific monoclonal antibody,is a potential treatment for patients with severe sepsis[J].J Endotoxin Res,2001,7(4)：310-314.

[19] Axtelle T,Pribble J.An overview of clinical studies in healthy subjects and patients with severe sepsis with IC14,a CD14-specific chimeric monoclonal antibody[J].J Endotoxin Res,2003,9(6)：385-389.

[20] Mollnes TE,Christiansen D,Brekke OL,et al.Hypothesis：combined inhibition of complement and CD14 as treatment regimen to attenuate the inflammatory response[J].Adv Exp Med Biol,2008,632：253-263.

[21] Thorgersen EB,Pharo A,Haverson K,et al.Inhibition of complement and CD14 attenuates the Escherichiacoli-induced inflammatory response in porcine whole blood[J].Infect Immun,2009,77(2)：725-732.

[22] O′Neill LA,Bowie AG.T he family of five：T IR domain-containing adaptors in T oll-like receptor signaling[J].Nat Rev Immunol,2007,7(5)：353-364.

[23] Kawai T,Akira S.T LR signaling[J].Semin Immunol,2007,19(1)：24-326.

[24] Aderem A,Ulevitch RJ.T oll-like receptors in the induction of the innate immune response[J].Nature,2000,406(6797)：782-787.

[25] Sha T,Sunamoto M,Kitazaki T,et al.Therapeutic effects of TAK-242,a novel selective Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor, in mouse endotoxin shock model[J].Eur J Pharmacol,2007,571(2-3)：231-239.

[26] Ii M,Matsunaga N,Hazeki K,et al.A novel cyclohexene derivative,ethyl(6R)-6-[N-(2-Chloro-4-fluorophenyl)sulfamoyl]cyclohex-1-ene-1-carboxylate TAK-242,selectively inhibits Toll-like receptor 4-mediated cytokine production through suppression of intracellular signalling[J].Mol Pharmacol,2006,69(4)：1288-1295.

[27] Kawamoto T,Ii M,Kitazaki T,et al.TAK-242 selectively suppresses T oll-like receptor 4-signaling mediated by the intracellular domain[J].Eur J Pharmacol,2008,584(1)：40-48.

[28] Medvedev AE,Piao W,Shoenfelt J,et al.Role of TLR4 tyrosine phosphorylation in signal transduction and endotoxin tolerance[J].J Biol Chem,2007,282(22)：16042-16053.

[29] Colonna M.TREMs in the immune system and beyond[J].Nat Rev Immunol,2003,3(6)：445-453.

[30] Gibot S,Massin F,M arcou M,et al.TREM-1 promotes survival during septic shock in mice[J].Eur J Immunol,2007,37(2)：456-466.

[31] Zhang JZ,Ward KW.Besifloxacin,a novel fluoroquinolone antimicrobial agent,exhibits potent inhibition of pro-inflammatory cytokines in human THP-1 monocy tes[J].J Antimicrob Chemother,2008,61(1)：111-116.

[32] Weiss T,Shalit I,Blau H,et al.Anti-inflammatory effects of moxifloxacin on activated human monocytic cells：inhibition of NF-κ B and mitogen-activated protein kinase activation and of synthesis of proinflammatory cytokines[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(6)：1974-1982.

[33] Yang CS,Ko SR,Cho BG,et al.The ginsenoside metabolite compound k,a novel ag onist of glucocorticoid receptor,induces tolerance to endotoxin-induced lethal shock[J].J Cell Mol Med,2008,12(5A)：1739-1753.

[34] Ogawa S,Lozach J,Benner C,et al.Molecular determinants of crosstalk between nuclear receptors and toll-like receptors[J].Cell,2005,122(5)：707-721.

[35] T subery H,Ofek I,Cohen S,et al.N-terminal modifications of polymyxin B nonapeptide and their effect on antibacterial activity[J].Peptides,2001,22(10)：1675-1681.

[36] T subery H,Ofek I,Cohen S,et al.Modulation of the hydrophobic domain of polymyxin B nonapeptide：effect on outer-membrane permeabilization and lipopoly saccharide neutralization[J].Mol Pharmacol,2002,62(5)：1036-1042.

[37] Ghiselli R,Giacomtti A,Cirioni O,et al.Cationic peptides combined with betalactams reduce mortality from peritonitis in experimented rat model[J].J Surg Res,2002,108(1)：107-111.

[38] Ghiselli R,Giacometti A,Cirioni O,et al.Neutralization of endotoxin in vitro and in vivo by Bac7(1-35),a proline-rich antibacterial peptide[J].Shock,2003,19(6)：577-581.