DNA 疫苗及其免疫途径的研究进展

楚琰，吴兴安

DNA 疫苗（DNA vaccine）又称为核酸疫苗、基因疫苗，是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗，采用某种方法直接导入动物细胞内，然后通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使被接种动物获得相应的免疫保护，以达到预防和（或）治疗疾病的目的。1990年，Wolff 等[1]发现小鼠的骨骼肌细胞能捕获含外源基因的质粒并表达外源基因，首次提出了基因免疫的概念。1992年，Tang 等[2]将含生长激素基因的质粒导入小鼠表皮细胞，88%的被免疫小鼠产生了抗生长激素抗体，二次免疫后抗体水平显著提高。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA 接种后既能刺激机体产生细胞免疫，又能产生体液免疫。于是，基因疫苗技术应运而生，并逐渐显示出作为第3 代疫苗的优越性。

最近几年来，关于基因免疫的研究在世界范围内广泛展开，所涉及的范围包括人和动物的各种细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病及肿瘤性疾病。目前，在医学上针对结核杆菌、艾滋病病毒、流感病毒和 T 细胞淋巴瘤的基因疫苗已进入临床阶段；而针对乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、狂犬病病毒、牛疱疹病毒、人乳头瘤病毒感染及相关癌症、巨细胞病毒、淋巴细胞脉络丛脑炎病毒、疟原虫、利什曼病、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等的核酸疫苗也正处于研究和开发之中。

虽然 DNA 疫苗研究已经取得长足的进展，但多数DNA 疫苗，尤其是针对大型动物和灵长类动物的 DNA 疫苗的免疫效果仍不理想，普遍存在免疫原性低、诱发的抗体滴度低以及不能完全清除病毒感染的问题，妨碍了其进一步的临床应用。因此，探索提高 DNA 疫苗有效性的策略和方法是目前 DNA 疫苗研制的重要环节。已有的研究表明，多种因素影响 DNA 疫苗的免疫效果，如目的基因的选择、质粒载体的选择、免疫佐剂的选择等，其中免疫途径的选择是一个重要方面。DNA 疫苗存在多种不同的免疫途径，不同免疫途径和免疫方式可对抗原 DNA 的吸收、表达和递呈产生影响，从而诱导出不同强度的免疫反应，其诱导的免疫应答机制也各不相同[3]。现有资料表明，不同 DNA 疫苗最佳的接种方式不同。因此，需根据客观情况进行优化选择。

本文就 DNA 疫苗免疫途径的研究进展作一综述。

1 注射免疫法

所谓直接注射法就是将重组质粒 DNA 直接注射到动物或人体的不同部位，如肌肉、静脉、腹腔、皮内和皮下等。该法需要大量重组质粒 DNA，但操作简单，无需复杂设备，是一种常用的方法。

1.1 肌肉注射

目前大部分研究者认为包括骨骼肌和心肌在内的横纹肌系统是最有效的摄取外源基因的组织[4]。肌肉组织具有安全、体积大、免疫接种容量大的优点，是一个可以长期分泌治疗性蛋白的有效平台，能引起有效的体液和细胞免疫应答，因此多被用来进行 DNA 免疫注射[5]。但是肌肉组织缺少相关的巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞，故其抗原提呈能力较弱。将质粒 DNA 注射进入肌肉组织后，最多只有1%～2%的肌纤维被转染，而影响质粒 DNA 扩散的主要屏障是肌束膜[4]。尽管如此，但由于肌肉组织的骨骼肌细胞可通过 T 小管或沟隙摄取 DNA，且可长时间持续表达，因而其内化质粒 DNA 及表达编码基因蛋白的能力远优于其他类型细胞，从而成为DNA 疫苗最主要的免疫方法之一。DNA 转染的效率还与质粒 DNA 的大小、构型、肌细胞的状态等有十分密切的关系。一般而言，DNA 分子越小，越有利于肌细胞的摄取，反之则扩散和摄取的效率越低。超螺旋闭合环状双链质粒构象对质粒进入肌细胞并在其中有效表达是十分有利的；而线性或开环的双链质粒 DNA 的转染效率则较低。对肌细胞而言，处于再生状态的肌细胞摄取质粒 DNA 的能力较强。

研究表明[6]，肌肉内接种诱发的免疫类型以 Th1 型为主，包括激活 CD8+ 的 CTL，CD4+ 的 Th1 细胞以及产生 IgG2a 为主的 B 淋巴细胞，且所获得的免疫力随免疫次数增加而不断加强。其产生 Th1 型优势应答的机制除与巨噬细胞和 NK 细胞活化产生 Th1 类细胞因子有关外，尚与肌肉的部位有关。骨骼肌所属淋巴结为周围淋巴结，其内有较多 Th1 类细胞及可提供 Th0 向 Th1 类细胞分化的微环境，这也是骨骼肌成为比较理想的肌注部位的原因之一。

1.2 静脉注射

有文献显示[7]，静脉注射的免疫保护效率与肌注无显著差异。主要是由于虽然静脉注射导入 DNA 的转染率很低，但其内丰富的抗原提呈细胞及其对特异抗原的识别和高效提呈，能够弥补转染率的不足。

1.3 腹腔注射

腹腔注射由于可迅速吸引众多巨噬细胞吞噬处理侵入的异物，所以获得免疫应答的速度较快，应答水平较高，但维持时间较短。已有实验证实，腹腔内注射裸 DNA 载体，可转染脾脏的 T 淋巴细胞和骨髓来源的造血干细胞，但是，极低的转染效率以及缺乏有效的抗原呈递作用，使得该途径的免疫保护效率很低。

1.4 皮内注射和皮下注射

皮肤是阻止外来病原进入体内的屏障，是一个复杂而有效的免疫监视器官，含有大量的专职抗原提呈细胞，如郎罕细胞（LC）和树突状细胞（DC）。皮内注射位点多样，实验动物可以在尾根部（离臀部皮肤 1cm 处）、腹部皮肤、足垫和耳廓等处，不同的注射位点引起的免疫应答机制不同[8]。皮下或皮内途径传递抗原可诱导出较强的体液免疫和细胞免疫应答，以 Th1 型反应为主[9-10]。研究显示，下颌下腺附近皮下注射 DNA 疫苗是一种较好的抵御口腔感染性疾病的策略。Guo 等[11]将带有葡糖基转移酶（GTFs）的C 末端糖苷结合区域（GLU）基因的 pGLUA 质粒，皮下注射免疫 SD 鼠，发现在唾液中诱生的特异性分泌型 IgA（sIgA）滴度显著高于经肌肉注射时唾液中的特异性 sIgA，且皮下注射途径也可诱导出血清中特异性抗细胞表面 A蛋白（PAc）的 IgG 抗体，显示皮下注射途径可诱导出系统免疫和黏膜免疫。Förg 等[8]以小鼠为模型，比较了三种不同的接种途径（骨骼肌、腹部皮肤、耳廓）所诱发的免疫反应，肌肉组织中目的基因表达时间最长，耳廓免疫引起的体液和细胞免疫应答最强，肌肉免疫最弱，由此可见质粒表达持续时间与免疫反应强弱无关，而且发现耳廓免疫可优先诱导基因免疫反应。

2 非注射免疫法

2.1 基因枪法（微弹轰击法）

基因枪法是一种全新的基因导入技术，它采用金或钨微粒为载体，以压缩气体（氦或氮）冲击波为动力，把研究人员理想目标中的遗传物质附着于高速金颗粒上，直接射入需要改造的动、植物细胞、组织或细胞器内，实现基因转移。该方法具有技术简单，能迅速、方便地转移基因，对于任何处于静止期或分裂期的靶细胞都可以进行基因转移，用比普通的注射法低 2～3 个数量级的 DNA 即可产生较高的保护作用，对治疗基因的大小要求不严格，安全性很高，可以获得持续时间较长的瞬时表达等优点[12]，是目前广泛应用且十分高效的免疫方法。

基因枪免疫无论是其介导产生的抗体效价还是其所需的 DNA 疫苗剂量，均优于肌注途径[13]。肌内注射所需DNA 疫苗的剂量是获得同等程度抗体反应的基因枪免疫所需 DNA 剂量的 100～1000 倍[14]。Fynan 等[7]用基因枪将甲型流感病毒的 DNA 疫苗送入小鼠的表皮中，发现仅用 0.4 μg 的 DNA 免疫 2 次即可使 90%的小鼠抵抗随后的病毒攻击，而肌内注射则需要 100 μg 的剂量。这可能是由于肌内注射途径中 DNA 是从细胞外被摄取，而基因枪途径则是 DNA 直接被轰击定位至细胞浆[15]。此外，Yoshida 等[16]还发现基因枪介导的免疫实验重现性远远好于肌肉注射。但是基因枪设备昂贵，子弹制作成本高，目前尚不具备普遍使用的条件。

2.2 表皮划痕法

所谓表皮划痕法即先用 70%酒精擦洗小鼠耳背皮肤，然后以注射针头划痕，再将溶于含 1%SDS 的 TE 溶液中的质粒 DNA 涂于划痕部位，其中 SDS 为透皮吸收促进剂。段明星等[17]将乙型肝炎病毒表面抗原基因质粒pGFP-HBsAg，分别采用肌肉注射、腹腔注射、表皮划痕三种免疫途径和不同剂量的裸露质粒 DNA 给小鼠进行免疫，以 ELISA 检测小鼠血清中抗 HBsAg 抗体变化。结果表明表皮划痕方式免疫的小鼠阳性率最高，且在相同剂量下其抗体滴度水平也最高，反应强度与他们曾经使用基因枪免疫的实验结果相似。但这方面工作还需进一步研究，以寻求更好的方法来提高基因转移效率，获得最佳免疫效果。

2.3 黏膜免疫法

黏膜免疫系统是机体免疫网络中重要的组成部分。黏膜表面是大部分病原生物侵入机体的主要部位。与非黏膜免疫相比，黏膜免疫除可引起机体产生全身免疫应答（如 IgG）外，还可诱导黏膜免疫应答，产生 sIgA，从而有效地提高机体的免疫保护力；同时，该免疫方法还具有给药途径安全、简便、无创伤等优点[18]。非侵入性黏膜免疫途径包括鼻内吸入、滴鼻、直肠内给药、阴道内给药、滴眼、口服、口内喷射接种等。据报道，所有黏膜免疫途径中以滴鼻效果最好。因为鼻腔上皮易接种，对大分子物质较少排斥，表面蛋白酶水平低于肠道[19]。Mora 和 Tam[20]报道，给麻醉小鼠鼻腔免疫包裹 HIV-1 包膜糖蛋白 gp120 的肽聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）微球可诱导出 gp120 相关的 CTL 和免疫应答，也能引起小鼠全身 CTL 应答。

黏膜免疫的机制包括诱生 sIgA、产生抗原提呈细胞介导的细胞毒作用以及诱导产生调节型 T 细胞[19]等。

2.4 电穿孔技术传递质粒 DNA

上述传递 DNA 疫苗的不同途径和方法，一般在小动物体内比灵长类动物体内更有效。到目前为止，仅少数实验在人体内观察到特异性的免疫反应，而在大量实验中并未观察到特异性的免疫反应[21-22]。在灵长动物体内未诱导出免疫反应的可能原因是 DNA 摄取量低，而电穿孔技术可克服这一难题。电穿孔通过脉冲电流增加靶细胞的渗透性而不致杀伤细胞，使亲水药物和 DNA 可以透过细胞膜；电穿孔技术能有效地传递质粒 DNA 至皮肤，在鼠、猪和灵长类动物模型中质粒 DNA 的表达提高了 100 倍，但其具体机制不清[23]。Schertzer 等[24]研究显示：用透明质酸酶预处理小鼠胫前肌，在 75 V/cm 的条件下进行电穿孔，经检测肌纤维表达报告基因率达 22%±5%，而且不会引起肌肉组织损伤。Otten 等[25]将 HIV 的 DNA 疫苗用电穿孔技术接种至猕猴体内，研究发现攻击感染的强度，与猕猴产生特异性抗体和细胞免疫反应持续的时间呈一定关联，提示利用电穿孔针对大动物传递质粒 DNA 是一项非常有效的技术。

3 非常规的其他免疫途径

上文所述的各种免疫途径是目前 DNA 疫苗应用较多的、较常规的免疫途径，除此之外，近些年还涌现出了一些新的非常规的免疫途径。其中，经涎腺投递基因疫苗的方式具有免疫原性强、安全性好等优点而受到人们重视。涎腺基因投递是将外源基因经导管逆行灌注投递至涎腺，继而表达基因所编码的蛋白质并将其分泌至血液或唾液，起到基因治疗的作用[26]。

涎腺是外分泌腺体，与皮肤和肌肉组织不同的是，涎腺的解剖与生理功能使其成为基因转导和蛋白表达的理想器官[27]，其解剖特点特别适用于基因疫苗的投递[28]：①涎腺有蛋白合成及分泌系统；②涎腺腺体分泌的蛋白可经基底膜至血液，经顶膜至唾液；③涎腺可通过导管系统无创逆行注射各种基因；④腺体的腺泡和导管均由单层细胞构成，一次注射即可将基因投递到绝大多数细胞；⑤经导管投递基因较经血液投递后针对载体的免疫反应及炎症反应轻得多。研究表明，经涎腺投递的基因疫苗不仅能够诱导体液免疫和细胞免疫，还能诱导强烈的黏膜免疫[29-32]。Voutetakis 等[33]把携带人促红细胞生成素基因的腺病毒相关病毒载体投递至小鼠涎腺，基因转导后 10 周分泌入血液中的人促红细胞生成素浓度达到最高，转基因稳定表达 54 周以上，小鼠的血液红细胞压积明显提高，且与血清促红细胞生成素含量呈正相关。王松灵等[34-37]在大鼠与小型猪体内经导管逆行投递基因转导研究的基础上进一步在小型猪涎腺放射损伤动物模型上转导水通道基因获得成功[36]，证明大型动物体内经涎腺逆行投递基因的可行性。经涎腺投递基因疫苗，可以预防或治疗口腔、消化道或全身疾病，虽然这方面的研究才刚刚起步，但其有潜在的发展前景。

4 多种途径联合免疫

研究表明，多种免疫途径联合使用策略，其免疫效果优于单种途径的免疫。Kudo-Saito 等[38]比较了用含有癌胚抗原（CEA）和三联的 T 细胞共刺激分子（B7-1、ICAM-1、LFA-3）的痘苗病毒（rV-CEA /TR ICOM）经不同途径接种的免疫效果和保护率，其免疫效果为初免皮下接种，再瘤内接种加强的联合免疫策略要优于皮下接种和瘤内接种单独免疫。Fynan 等[7]比较了甲型流感病毒血凝素 DNA 疫苗经不同途径接种的免疫效果和保护率，结果无论是小鼠还是鸡，其免疫效果均以多种途径联合免疫为最好。

5 结语

DNA 疫苗是 21 世纪新型疫苗发展的趋势，它不仅有可能成为病毒、细菌或寄生虫等感染性疾病的预防性疫苗，同时也可能作为非感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病等的治疗性疫苗。目前，DNA 疫苗已成为疫苗研究领域中的热点之一。DNA 疫苗的接种有多种途径，不同的免疫途径，诱导免疫保护力的强弱和维持的时间也不尽相同。各种途径各有自身的优缺点。一般来说，皮内注射（耳廓）诱导的免疫应答较强，肌肉注射诱导的免疫持续时间较长，黏膜免疫不仅诱导黏膜免疫还可诱导系统免疫，电穿孔技术对大动物免疫效率较高，基因枪免疫质粒用量少，免疫效果较好，而各种接种途径的联合运用可能是新的研究方向。今后，还需要进一步研究，阐明各种接种途径的免疫机制，以寻求更好的接种方法来提高基因转移的效率，获得最佳的免疫保护效果。

[1]Wolff JA, Malone RW, Williams P, et al.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science, 1990, 247(4949 Pt 1):1465-1468.

[2]Tang DC, Devit M, Johnston SA.Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.Nature, 1992, 356(6365):152-154.

[3]Da'dara AA, Skelly PJ, Fatakdawala M, et al.Comparative efficacy of the Schistosoma mansoni nucleic acid vaccine, Sm23, following microseeding or gene gun delivery.Parasite Immunol, 2002, 24(4):179-187.

[4]Ertl HC, Xiang Z.Novel vaccine approaches.J Immunol, 1996,156(10):3579-3582.

[5]McMahon JM, Wells DJ.Electroporation for gene transfer to skeletal muscles: current status.BioDrugs, 2004, 18(3):155-165.

[6]Xu XM, Song GX, Si JY.Advance in research on DNA vaccine.Prog Microbiol Immunol, 2002, 30(1):65-70.(in Chinese)许雪梅, 宋国兴, 司静懿.DNA疫苗机制研究进展.微生物学免疫学进展, 2002, 30(1):65-70.

[7]Fynan EF, Webster RG, Fuller DH, et al.DNA vaccines: Protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations.Proc Natl Acad Sci U S A, 1993, 90(24):11478-11482.

[8]Förg P, von Hoegen P, Dalemans W, et al.Superiority of the ear pinna over muscle tissue as site for DNA vaccination.Gene Ther, 1998,5(6):789-797.

[9]Ayash-Rashkovsky M, Weisman Z, Zlotnikov S, et al.Induction of antigen-specific Th1-biased immune responses by plasmid DNA in schistosoma-infected mice with a preexistent dominant Th2 immune profile.Biochem Biophys Res Commun, 2001, 282(5):1169-1176.

[10]Liu L, Zhou X, Liu H, et al.CpG motif acts as a ‘danger signal’ and provides a T helper type 1-biased microenvironment for DNA vaccination.Immunology, 2005, 115(2): 223-230.

[11]Guo JH, Jia R, Fan MW, et al.Construction and immunogenic characterization of a fusion anti-caries DNA vaccine against PAc and glucosyltransferase I of Streptococcus mutans.J Dent Res, 2004,83(3):266-270.

[12]Wang YB, Yu XL.The development of gene gun technology.Mod Scientific Instruments, 2003, (3):41-45.(in Chinese)王友冰, 余兴龙.基因枪技术发展综述.现代科学仪器, 2003, (3):41-45.

[13]Trimble C, Lin CT, Hung CF, et al.Comparison of the CD8+ T cell responses and anti-tumor effects generated by DNA vaccine administered through gene gun, biojector, and syringe.Vaccine, 2003,21(25/26): 4036-4042.

[14]Pertmer TM, Eisenbraun MD, McCabe D, et al.Gene gun-based nucleic acid immunization: elicitation of humoral and cytotoxic T lymphocyte responses following epidermal delivery of nanogram quantities of DNA.Vaccine, 1995, 13(15):1427-1430.

[15]Eisenbraun MD, Fuller DH, Haynes JR.Examination of parameters affecting the elicitation of humoral immune responses by particle bombardment-mediated genetic immunization.DNA Cell Biol, 1993,12(9):791-797.

[16]Yoshida A, Nagata T, Uchijima M, et al.Advantage of genegun-mediated over intramuscular inoculation of plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immune responses.Vaccine, 2000, 18(17):1725-1729.

[17]Duan MX, Zhuang FF, Zhou ZH, et al.A comparative study on the inoculation routes of gene immunization.Shanghai J Immunol, 1999,19(5):275-276, 279.(in Chinese)段明星, 庄峰锋, 周志红, 等.几种不同基因免疫途径的比较研究.上海免疫学杂志, 1999, 19(5):275-276, 279.

[18]MacDonald TT.The mucosal immune system.Parasite Immunol,2003, 25(5):235-246.

[19]Czerkinsky C, Anjuere F, McGhee JR, et al.Mucosal immunity and tolerance: relevance to vaccine development.Immunol Rev, 1999,170:197-222.

[20]Mora AL, Tam JP.Controlled lipidation and encapsulation of peptides as a useful approach to mucosal immunizations.J Immunol, 1998,161(7):3616-3623.

[21]Wang R, Doolan DL, Le TP, et al.Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by a malaria DNA vaccine.Science, 1998, 282(5388):476-480.

[22]Calarota S, Bratt G, Nordlund S, et al.Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients.Lancet, 1998,351(9112):1320-1325.

[23]Giri M, Ugen KE, Weiner DB.DNA vaccines against human immunodeficiency virus type 1 in the past decade.Clin Microbiol Rev,2004, 17(2):370-389.

[24]Schertzer JD, Plant DR, Lynch GS.Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.Mol Ther, 2006, 13(4):795-803.

[25]Otten G, Schaefer M, Doe B, et al.Enhancement of DNA vaccine potency in rhesus macaques by electroporation.Vaccine, 2004, 22(19):2489-2493.

[26]Hai B, Wang SL.Advance in research on genetic therapy of salivary glands.Foreign Med Sci, 2006, 33(2):87-89.(in Chinese)海波, 王松灵.涎腺基因疗法的研究进展.国外医学口腔医学分册,2006, 33(2):87-89.

[27]Goldfine ID, German MS, Tseng HC, et al.The endocrine secretion of human insulin and growth hormone by exocrine glands of the gastrointestinal tract.Nat Biotechnol, 1997, 15(13):1378-1382.

[28]Wang SL.Non-tumor salivary gland diseases.Beijing: Science and Technology Press, 2001:206-216.(in Chinese)王松灵.涎腺非肿瘤疾病.北京: 科学技术文献出版社, 2001:206-216.

[29]Kawabata S, Terao Y, Fujiwara T, et al.Targeted salivary gland immunization with plasmid DNA elicits specific salivary immunoglobulin A and G antibodies and serum immunoglobulin G antibodies in mice.Infect Immun, 1999, 67(11):5863-5868.

[30]Sankar V, Baccaglini L, Sawdey M, et al.Salivary gland delivery of pDNA-cationic lipoplexes elicits systemic immune responses.Oral Dis, 2002, 8(6):275-281.

[31]Tucker SN, Lin K, Stevens S, et al.Systemic and mucosal antibody responses following retroductal gene transfer to the salivary gland.Mol Ther, 2003, 8(3):392-399.

[32]Tucker SN, Lin K, Stevens S, et al.Salivary gland genetic vaccination:a scalable technology for promoting distal mucosal immunity and heightened systemic immune responses.Vaccine, 2004, 22(19):2500-2504.

[33]Voutetakis A, Kok MR, Zheng C, et al.Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics.Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9):3053-3058.

[34]Wang SL, Baum BJ, Yamano S, et al.Adenoviral-mediated gene transfer to mouse salivary glands.J Dent Res, 2000, 79(2):701-708.

[35]Li J, Zheng C, Zhang X, et al.Developing a convenient large animal model for gene transfer to salivary glands in vivo.J Gene Med, 2004,6(1):55-63.

[36]Shan Z, Li J, Zheng C, et al.Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1 cDNA to irradiatedminiature pig parotid glands.Mol Ther, 2005, 11(3):444-451.

[37]Shan ZC, Li J, Liu XY, et al.Adenoviral-mediated transfer of the human aquaporin-1 cDNA to irradiatedminipig parotid glands.Beijing J Stomatology, 2005, 13(3):141-144.(in Chinese)单兆臣, 李钧, 刘晓勇, 等.水通道基因治疗小型猪腮腺放射损伤的研究.北京口腔医学, 2005, 13(3):141-144.

[38]Kudo-Saito C, Schlom J, Hodge JW.Intratumoral vaccination and diversified subcutaneous/intratumoral vaccination with recombinant poxviruses encoding a tumor antigen and multiple costimulatory molecules.Clin Cancer Res, 2004, 10(3):1090-1099.