高表达FoxO1抑制猪骨骼肌成肌细胞的分化

袁媛，史新娥，刘月光，杨公社

西北农林科技大学动物科技学院 动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌 712100

FoxO家族是一群拥有保守的 Fork区域的转录调控因子，能够和TTGTTTAC序列相似性高或一致的序列结合，主要参与DNA修复、细胞分化、凋亡和代谢[1]。FoxOs作为转录活化因子，其活性受多条信号通路的调节，包括胰岛素、PI3K/Akt等，其作用方式是对 FoxOs特定的氨基酸位点进行磷酸化/去磷酸化的调控[2]。FoxOs特异性的氨基酸位点一旦被磷酸化后，将从细胞核内转移到胞质中，此时便失去转录调控活性，其功能亦被抑制，因此 FoxOs在核内外的转位决定了其对靶基因转录的调控[3]。近几年的研究表明，该家族成员FoxO1在骨骼肌的分化、生长与代谢过程中扮演重要角色，但其调控方式仍存在争议，分子机制尚 不清楚。

3.4 肠道菌群与更年期综合征 更年期综合征指部分妇女由于卵巢功能衰退或丧失，因性激素波动或急剧减少，引起机体内分泌失调、免疫力低下和植物神经紊乱的症候群，可导致全身多个系统的病理变化[28]。近年来越来越多研究证明，肠道菌群的改变会引起体内代谢紊乱，且与高级神经精神活动存在密切关系，说明肠道菌群改变可能与更年期的一系列症候群存在一定关系。郭在清[29]研究结果显示，更年期综合征人群肠道双歧杆菌数量显著减少，肠杆菌科及肠球菌细菌数量显著增加，益生菌群与肠杆菌科结构发生改变，可能更年期综合征人群由于神经内分泌失调等健康状态的下降，引起肠道有益菌群与腐败菌比例发生变化，从而引起肠道微生态失调。

猪肉是我国肉类生产的主体，目前提高瘦肉率、改善肉品质已成为猪育种的主要研究方向。骨骼肌是肌肉的主要组成部分，其生长发育非常复杂，涉及到大量基因的表达及网络调控。FoxO1的表达和活性与骨骼肌的发育密切相关，但目前关于其在肌肉发育中的调控方式仍不十分清楚。因此，本实验诱导体外培养的猪原代骨骼肌成肌细胞分化，检测FoxO1在此过程中的表达变化，并通过将FoxO1基因导入猪成肌细胞，探索FoxO1对成肌分化的影响，为进一步揭示FoxO1调节肌肉发育的作用机理奠定基础。

这主要是指大断面浅埋偏压隧道在开始时要注意控制标准面上下部的每循环开挖尺寸。大体而言，上导洞的每循环开挖尺寸应控制在0.5m内，下导洞视周围岩石的稳定情况定位0.5～1m，保证下部落后于上部约5～10m。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

3日龄健康长白仔猪由西北农林科技大学种猪场提供，体重1.5~2.5 kg，取样前用0.5%的新洁尔灭清洗0.5 h左右，电击处死。

1.1.2 主要试剂

含目的基因 FoxO1的 pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1质粒和空质粒pcDNA3由Haojie Huang教授 (Minnesota University，USA) 惠赠。脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Opti-MEM (Invitrogen)、G418 (Gibco)、DMEM/F12培养基(Gibco)、链酶蛋白酶 (Sigma)、胎牛血清 (杭州四季青)、马血清 (Gbico)、Trizol (TaKaRa)、反转录试剂盒PrimeScript RT-reagent Kit (TaKaRa)、DNAseⅠ(TaKaRa)、实时定量试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time) (TaKaRa)、抗FoxO1、P-FoxO1 (Ser256)、MyoD、β-actin和FLAG抗体均购自美国 Santa Cruz公司，抗 myogenin 购自Millipore公司。其他试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 猪骨骼肌成肌细胞的原代培养及分化诱导

FoxO1是多条信号通路中重要的转录因子，调控细胞增殖、分化和凋亡等生理过程，其活性受到磷酸化/去磷酸化的调控[5-6]。本实验室庞卫军及其他学者的研究表明，FoxO1广泛表达于各种组织器官中，包括脂肪、骨骼肌和肝脏等并能够抑制脂肪细胞的分化[7-8]。众多研究证实，FoxO1在肌肉发育与分化中起到重要作用。Bois等研究指出FoxO1可以促进小鼠原代成肌细胞的终末分化[9]，同年又有研究发现C2C12小鼠成肌细胞系的分化受到FoxO1转录因子的抑制[10]。Kamei等构建了骨骼肌特异的FoxO1转基因小鼠，发现骨骼肌重量明显减少[11]。这些研究均表明，FoxO1转录因子在骨骼肌的分化中扮演重要角色，但调控方式仍存在争议，需要进一步的研究证实。因此，我们首先检测了猪原代成肌细胞分化过程中FoxO1的表达情况。结果显示，在猪成肌细胞的分化过程中，FoxO1基因的表达量显著上调，而总蛋白表达量变化并不显著，其磷酸化水平呈现上升趋势，表明FoxO1的失活状态对于成肌细胞的分化是非常必要的。

依照本实验室已建立的方法[4]，培养猪原代骨骼肌成肌细胞。原代细胞以0.5×106个/cm2密度接种至六孔培养板内，置于 5% CO2、37℃恒温培养箱内培养。48 h后更换培养基，此后每隔2 d换液1次。当细胞汇合至60%~70%时，将含15%胎牛血清的培养液换成 2%马血清的培养基诱导分化，持续培养5 d，收集细胞进行后续检测。

[3] Van Der Heide LP, Hoekman MF, Smidt MP. The ins and outs of FoxO shuttling: mechanisms of FoxO translocation and transcriptional regulation. Biochem J, 2004, 380(Pt 2): 297−309.

1.2.2 脂质体介导质粒转染猪原代成肌细胞

原代猪骨骼肌成肌细胞在含15%胎牛血清和抗生素的 DMEM/F-12培养基中常规培养，取对数生长期细胞转入六孔板，加入含15%小牛血清而无抗生素的培养基继续培养，当细胞汇合至 60%~70%时进行转染。转染步骤按说明书进行，先将4 μg的质粒DNA稀释于250 μL培养基中，再将10 μL的Lipofectamine 2000稀释于250 μL培养基中，5 min后将二者混合，混匀后室温放置20 min。更换待转染细胞的培养基为Opti-MEM (Invitrogen) 培养基，加入DNA和Lipofectamine 2000的混合物，培养5 h后更换为含15%胎牛血清无抗生素的培养基。为了获得稳定表达目的基因的细胞株，在培养基中添加200 μg/mL的G418，继续培养7~14 d，筛选具有G418抗性的细胞。最后用Western blotting筛选转染成功的细胞。

超前网络化：①对照月度作业计划，基层队组三日内超前制定网络工期表；②各专业科室对照网络，详细列出当月超前管理的变化环节，进行跟踪落实；③突出对超前探测地质变化，准确掌握构造位置、类型、产状等信息，制定相关安全技术措施，跟踪落实。

1.2.3 引物设计

根据 GenBank已发表的基因序列 (FoxO1、MyoD、Myogenin、β-actin 的GenBank 登录号分别为：NM_214014.2，NM_001002824，NM_001012406，NM_007393)，严格按照实时定量引物设计原则，应用Primer Premier 5.0软件，设计引物进行目的基因扩增。引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for genes

1.2.4 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

按照RNAiso Plus (TaKaRa) 总RNA提取试剂说明书提取诱导分化第 0、3、5天的猪原代成肌细胞的总 RNA，用 DNaseⅠ处理后，1%琼脂糖凝胶检测RNA的完整性并用Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量仪对 RNA定量，随后用反转录试剂盒合成cDNA第一链。

1.2.5 实时荧光定量PCR

“两线合一”的划定是一个集自然、社会与经济的符合生态系统，本文以生态控制的视角，将城市开发边界与生态安全关联起来，结合以往城市“两线合一”的划定经验，将其分类研究，探索“两线合一”的划线模式，并以北京城市副中心的“两线合一”划定为例，提出“守住底线，总量控制，留有余地”的生态控制型城市开发边界与生态红线“两线合一”的划线方法。

利用Smart Cycler II (Cepheid公司) 实时PCR系统进行实时定量扩增。反应总体系25 μL，其中：灭菌的ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物 (10 μmol/L) 1 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×) 12.5 μL。采用两步法PCR反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共45个循环。基因的相对表达采用2−ΔΔCt公式计算。

改革和完善农村社会保障制度，既是维护最广大农民群众的根本利益的必然要求，也是我国实现全面建设小康社会目标的重要路径，对于实现城乡统筹，社会和谐具有极大的重要意义。因此，基于我国当前农村公共产品供给现状，结合当前经济社会实际情况，就完善社会保障制度的建设，从三个方面提出以下一些建议与思考：

1.2.6 Western blotting

伊德里斯的地图中雅朱者和马朱者出现在中国北方(见图3)，在“亚历山大边墙”后面有一块铭文，写着“属于包围雅朱者和马朱者的库法亚(Kufaya)山脉”。边墙有门，大门处标识了亚历山大的阿拉伯名字杜尔-卡奈因(Dul-Karnai)。

HCY是蛋氨酸循环的中间代谢产物，是含硫的氨基酸。有研究发现，HCY在代谢过程中损伤血管内皮细胞，是心脑血管疾病的独立危险因子之一[6-7]；致病机制是由于HCY是中间代谢产物，在体内的不稳定性，易产生过氧化物和氧自由基，启动低密度脂蛋白的过氧化反应，导致肾组织细胞的损害和凋亡，从而加速病情的进展；HCY能促进动脉平滑肌细胞增生并加快动脉粥样硬化斑块形成；同时HCY通过激活凝血因子和促进血小板聚集来启动凝血功能，降低纤溶活性，从而使增加血栓形成概率。该研究结果显示，血清HCY的表达水平与ACR呈正相关，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），监测HCY水平有助于判断DN的发生发展。

1.2.7 数据统计分析

去除培养皿中的培养液，PBS洗1遍，每皿加入 200 μL的细胞裂解液。当细胞充分裂解后，12 000×g离心5 min，取上清，以BradFord方法对总蛋白质进行定量。提取的总蛋白95℃加热10 min，10% SDS-PAGE分离蛋白，接着以200 mA的电流将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，用抗FoxO1、P-FoxO1 (Ser256)、MyoD、myogenin、β-actin和 FLAG的抗体 (1∶200)，4℃孵育过夜。再与对应的辣根过氧化物酶偶联的二抗 (1∶2 000)室温下孵育2 h，最后利用Bio-Rad GS-800曝光系统检测目的蛋白，并用Quantity One软件分析蛋白表达量。

采用SPSS13.0统计分析软件One-way ANOVA进行方差分析与显著性检验。

2 结果与分析

2.1 猪原代成肌细胞的分化

猪原代成肌细胞培养48 h后，贴壁，形态呈长梭形 (图1A)。2%马血清诱导分化3 d后，成肌细胞变得细长，开始融合 (图1B)。诱导分化5 d后，可以看到有肌管形成 (图1C)。

2.2 猪原代成肌细胞分化过程中 FoxO1的表达变化

检测原代猪成肌细胞FoxO1在分化0、3、5 d表达的变化。实时定量 RT-PCR结果表明，在猪成肌细胞分化过程中，FoxO1 mRNA表达显著上调(图2A)。然而，Western blotting检测结果发现，在此过程中FoxO1总蛋白的表达量没有显著变化，但其磷酸化水平显著增加 (图2B−D)。

罗恬隐隐觉得有些不安，赵炎始终没有消息，公司里也没人知道他去了哪里，电话也打不通。更让罗恬不安的是，她总觉得这幢大房子里，还藏着另一个人。有时她会听到一楼传来沉闷的脚步声。有时会听到阁楼里“咔咔”的机械声，那些莫名响起的声音，在寂静的深夜里听起来格外诡异。

2.3 FoxO1质粒成功感染猪原代成肌细胞的鉴定

原代猪成肌细胞转染空质粒 pcDNA3和pcDNA3- FLAG-tagged FoxO1质粒72 h后，提取细胞蛋白进行Western blotting，检测FoxO1蛋白表达情况。如图3所示，稳定转染pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1质粒的猪成肌细胞中FoxO1表达显著提高，同时也可检测到FLAG标签的表达。

由此，最终确定以下6个企业协调联动的关键影响因素：相互依赖与信任(IT)、不确定性(UC)、企业文化(EC)、信息沟通与共享(ICS)、利益分享(BS)、政策法律环境(PLE)。各因素对企业之间协调联动机制实施效果的影响最终通过战略目标(SO)和协调绩效(CP)指标来反映。

图1 猪原代成肌细胞体外培养及诱导分化形态图Fig. 1 Differentiation and morphometric analysis of pig skeletal muscle myoblast differentiation at 0 day (A), 3 day (B) and 5 day (C).

图2 猪原代成肌细胞分化过程中FoxO1的表达变化Fig. 2 FoxO1 expression pattern during pig myoblast differentiation. Real-time PCR (A) and Western blotting (B) were performed to quantify the the time-course expression of FoxO1 during myoblast differentiation. (C−D) Densitometric analysis of total FoxO1and FoxO1 phospholation normalized against β-actin, respectively. *P<0.05.

图3 质粒成功导入猪成肌细胞的鉴定Fig. 3 Identification of plasmids transfected into porcine myoblasts successfully by Western blotting.

2.4 FoxO1过表达对猪原代成肌细胞分化的影响

对稳定转染空质粒pcDNA3和pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1质粒的猪成肌细胞进行分化诱导，观察诱导分化第5天时细胞的形态学变化。结果发现，对照组空质粒在诱导5 d后，细胞正常分化，并有肌管形成 (图4B)。然而，过表达 FoxO1的猪成肌细胞虽也进行分化并呈现梭形生长，但成肌分化进程被明显推迟，未能形成肌纤维 (图4D)。

2.5 FoxO1过表达对猪原代成肌细胞分化标志基因的影响

图4 高表达FoxO1推迟猪成肌细胞的分化进程Fig. 4 Over-expression of FoxO1 delayed pig myoblast terminal differentiation. Differentiation and morphometric analysis of pig skeletal muscle myoblast differentiation at 0 day and 5 day in control (A and B) and FoxO1-infected cells (C and D), respectively.

对稳定转染空质粒pcDNA3和pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1质粒的猪成肌细胞进行分化诱导，分别检测诱导分化第3天 (D3) 和第5天 (D5) 时，成肌分化早期标志基因MyoD和晚期标志myogenin的表达变化。如图5A所示，对照组细胞中MyoD在成肌细胞早期表达，分化第 3天达到峰值，分化末期 (D5) 表达量回到基础水平。成肌分化晚期标志myogenin随着分化时间的推移逐渐升高 (图 5C)。高表达FoxO1的猪成肌细胞中，MyoD 和myogenin mRNA含量均显著降低 (P＜0.05) (图 5A、5C)。Western blotting检测结果发现高表达FoxO1的猪成肌细胞中MyoD蛋白表达量略有下降，但差异并不显著，而 myogenin蛋白表达量与转录水平保持一致，受到显著抑制 (图5B、5D、5E)。

3 讨论

After adding metamaterial to the design of simple patch， the structure will be as below:

“地者，政之本也！”土地资源是农民赖以生存的物质保证，是生活生产中不可或缺的重要组成部分，土地政策更是盘活土地资源，带领农民脱贫致富的保证，是精准扶贫工作稳步前行，各项政策落地的物质保障。做好土地政策研究、制定与落实，是盘活土地资源，释放土地价值，助推其他精准扶贫政策有效实施的基础性工作。

图5 高表达FoxO1对猪成肌细胞分化标志基因的影响Fig. 5 Over-expression of FoxO1 inhibited pig myoblast terminal differentiation. Real-time PCR (A and C) and Western blotting (B and D) showed the changes of early and late myogenic factors (MyoD and myogenin) in control and FoxO1-infected cells. (E) Densitometric analysis of MyoD and myogenin at 5 days differetiation (D5) normalized against β-actin. *P<0.05.

MyoD 和 myogenin属于生肌调节因子家族(Myogenic regulation factors，MRFs)，可激活肌肉的基因转录，抑制肌细胞增殖，促进分化，在骨骼肌发生早期起到重要的调节作用[12-13]。本实验室杨燕军等[14]通过对不同品种猪背最长肌的组织差异分析发现FoxO1和MyoD基因的表达在肌肉发育中存在负相关 (P＜0.05)。为了进一步证明 FoxO1在成肌分化中的作用，我们构建了稳定表达FoxO1的猪原代成肌细胞株，并检测了早期和晚期成肌标志分子MyoD和myogenin的表达情况。与对照组成肌细胞相比，过表达 FoxO1的猪成肌细胞中，MyoD和myogenin基因在转录水平的表达量受到显著抑制(P＜0.05)。同时，Western blotting结果显示早期成肌标志 MyoD蛋白表达量虽受到抑制但变化不明显，然而晚期标志myogenin蛋白表达与其基因表达保持一致，显著下调 (P＜0.05)。这些结果表明，FoxO1可以通过抑制早期标志基因MyoD推迟成肌细胞的分化，并进一步通过抑制肌肉形成的晚期标志分子myogenin阻遏肌肉的分化。

同时，生肌调节因子不仅在成肌分化中发挥重要作用，由于其调控收缩蛋白和调节蛋白同工型在不同时期表达，也可以促使肌肉细胞向不同类型的肌纤维分化[15-16]。已有研究证实，MyoD在快肌纤维中优先表达，而myogenin在慢肌纤维中表达较多[17]。骨骼肌特异的FoxO1转基因小鼠中，慢肌纤维数量明显减少而快肌纤维数量没有明显改变[11]。然而小鼠骨骼肌中特异性地敲除FoxO1可以改变原有的肌纤维类型组成，快肌纤维含量上调并伴随慢肌纤维的减少，同时检测到MyoD基因表达量的增加[18]。本实验所得结果与这些研究一致，表明FoxO1在控制肌纤维分型中也发挥重要作用，并提示FoxO1可能通过调节生肌调节因子控制肌纤维类型的分化。然而，对于FoxO1调控肌纤维类型特异性分化的具体机制还有待深入研究。

综上所述，本研究表明FoxO1转录因子在猪原代成肌细胞分化中发挥负调节作用，能够推迟并抑制猪成肌细胞的分化，并可能参与调控骨骼肌纤维类型的终末分化。

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余传伟的水彩画有一种别样的气息。读他的画就如同吟一首民国时期的抒情叙事小诗，感动便不经意的在心里流淌了，自然、随性，并隐约有故事。

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如前所属，本次改造工程只有厂区西侧的细长地块和东侧厂前区少量预留用地可作为深度处理设施用地，综合比较，我们选择占地面积最小、工艺流程最简单、运行费用较低、运行管理简单的滤布滤池方案作为本工程过滤方案。

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