花粉管通道法在玉米转基因育种中的应用

李向龙，张力全，张晓东

（北京农业生物技术研究中心，北京 100089）

玉米是世界主要粮食饲料和工业原料之一，随着社会的不断进步，世界各国对玉米的需求量逐年增加。预计到2020年，发展中国家对玉米的需求量估计会比1995年增加50%，到2030年,我国的玉米需求量将会达到1.60亿 ～1.75亿t[1]。但是，目前的玉米生产和玉米育种中面临着推广品种单一化、育种材料遗传基础越来越狭窄、基因库日益贫乏的问题，加之常规育种周期长，预见性差，故20世纪70年代以来，研究者开始利用基因转化方法 （如EFG介导原生质体转化法、电激转化法、子房注射法以及花粉管通道法等）定向改造玉米的某些性状，加快了玉米的育种进程[2]。本文就目前玉米自交系转基因育种中花粉管通道法应用的研究成果作一综述。

1 花粉管通道法的提出

花粉管通道法是我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”报道的研究成果。其原理是将外源DNA片段在作物受粉后特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿着花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备正常细胞壁的受精卵、合子及早期胚胎细胞[3]。花粉管通道法自问世以来，引起国际上的广泛关注，美、欧、亚等一些实验室将这一技术应用于稻、麦、棉、豌豆、牧草等基因重组和总DNA导入的研究中，其中在水稻、小麦等粮食作物上的应用比较多，在一定程度上拓宽了其种质基础，但在改良玉米育种中应用较少。

2 花粉管通道法在玉米改良上的应用

2.1 研究内容

目前，花粉管通道法用于改良玉米自交系的研究主要集中在抗虫、抗除草剂以及提高植株抗逆性上，其中抗除草剂和抗Bt虫蛋白基因的研究成果显著，孟山都和先正达两个国际知名公司已将其推广应用于生产中。

2.2 研究成果

在玉米自交系改良中，国内外学者利用花粉管通技术获得的品种有30多个。1986年Ohta在美国科学道技术取得了大量有价值的成果，据统计，每年利用此院报上报道应用外源 DNA与玉米花粉混合授粉，得到F0转化率高达10%的胚乳基因转移[4]。王秀君等采用花粉管通道法将含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2导入优良玉米自交系X90中，经检测有阳性植株为29株[5]。张慧英等提取甘蔗DNA，采用该方法将其导入普通玉米自交系普7313，从自交后代中选出2个叶绿素、可溶性糖、蛋白质含量均比对照提高的优良株系；他们还将提取的糯质玉米12-9-10 DNA导入甜玉米自交系孟加拉超甜玉米，其后代产生了株高、穗位高、叶面积等性状上的变异[6,7]。王罡等采用该技术，以生产上7922等9个优良玉米自交系为材料，将Bt杀虫蛋白基因导入其中，最终得到3株抗性转化植株[8]。关淑艳等利用该技术将淀粉分支酶基因的反义表达载体转入玉米自交系铁7922、吉853、丹 340、Mo17、5003 和春 09 中，初步证明外源目的基因已整合到玉米基因组中，并得到了转化植株的种子[9]。刘丹梅以抗虫的胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI)为供体，以8个品种玉米为受体进行外源DNA直接导入，通过对抗性植株的初步分子鉴定，证实外源CpTI基因存在并整合入获得的玉米基因组植主中[10]。此外，研究者还在玉米自交系抗逆性上取得一定成果，例如丁群星等研究发现玉米矮花叶病毒 (MDMV)B株外壳蛋白在转基因植株中表现出对MDMV的抗性；张永胜等人还研究了将抗旱耐盐基因以及抗叶斑病基因导入玉米自交系中，并获得了初步成功[11,12]。

2.3 花粉管通道法转化方式

花粉管通道法将外源DNA导入玉米自交系中的转化方式有柱头滴加法、花粉粒携带法、子房微注射法、开苞导入法等。但笔者结合自身经历，认为柱头滴加法不论从转化效率还是对幼穗的伤害程度上都有一定的优势。该方法的主要技术手段是选取自交授粉后18～26 h的玉米果穗，剪去距穗顶部l cm以上的苞叶和花丝，将DNA滴在切口处，外源DNA经花粉进入时形成的通道进入幼胚，从而完成外源DNA导入过程。1995年祁永红等报道了利用猪头滴加法成功将外源总DNA导入玉米自交系，此后又有研究者陆续报道了利用该法获得了具有广泛变异的不同类型的玉米自交系[13 ～15]。

3 花粉管通道法应用前景展望

花粉管通道法优势众所周知，其在玉米自交系转基因育种中应用越来越普遍，但其转化效率低仍然是制约其应用的瓶颈，如何进一步提高其导入率将是今后很长一段时间研究的重点；此外，对玉米受粉后花粉管通道形成的生理机制、导入外源DNA的最佳时间以及转基因后代可能产生的变异等还不能很好的解决，这在一定程度上将限制其发展。今后，应当进一步完善分子育种技术的理论和应用研究，以充分发挥其简便快速的优势，提高育种水平，培育出更多更好的优良新品种。

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