结核分枝杆菌持留生存机制的研究进展
2010-02-09何子纯李升锦
何子纯 李升锦
(重庆医科大学附属第二医院呼吸科 重庆 400010)
结核分枝杆菌持留生存机制的研究进展
何子纯 李升锦
(重庆医科大学附属第二医院呼吸科 重庆 400010)
全球约有1/3人口被结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染,但只有10%的感染者可发生结核病,而绝大多数是以潜伏感染形式存在。MTB的潜伏感染决定于MTB能在宿主体内以持留状态存在的能力。处于持留状态的MTB能抵抗巨噬细胞的吞噬杀灭作用,并能耐受通常对生长繁殖期的MTB具有杀灭作用的抗结核药的杀灭作用[1]。因此,研究MTB进入代谢或休眠持留期和在持留状态下存活的机制,进而寻找抑制其进入持留期和杀灭结核持留菌的方法,对于控制和根除结核病具有重要的临床意义。
1 结核持留菌的研究背景
MTB是一种兼性细胞内寄生菌,并借胞内环境避免暴露于任何细胞外免疫系统。人们常以M TB在宿主体内以非增殖状态存在从而造成延缓性病程和导致复发的潜伏形式称为持留现象和持留性,引起这种现象的菌群称为持留菌。结核持留菌的存在很早就得到体内外实验的证实,20世纪 50年代McCune等[2]在 Cornell模型中用大剂量有毒株MTB感染小鼠,并让疾病进展2周,再用抗结核药物治疗,后取小鼠的肺和脾脏培养发现无MTB生长,停止治疗间隔一段时间后MTB又会重新在这些组织出现,因此McCune认为这些组织中可能存在休眠持留状态的M TB[2]。1995年,de Wit等[3]用PCR法在一小鼠休眠结核病模型中证实,经异烟肼和利福平长期化疗后培养无菌的组织内有MTBDNA的存在,化疗停止后脏器培养可复阳。Wayne等[4]用逐渐降低培养液中氧浓度的方法将MTB诱导进入休眠持留状态,发现生长繁殖期MTB和休眠持留期MTB的异柠檬酸水解酶(isocitrate lyase,ICL)、触酶以及超氧化物歧化酶等的浓度差异有统计学意义。然而目前仍不清楚是否细菌的发育状态的改变使得他们不能被免疫系统识别,亦或是可能由于细菌表面模式的改变使其免疫原性改变而无法被免疫系统识别。随着分子生物学研究的快速发展,对结核持留菌的认识也在不断深入。
2 MTB持留生存机制
MTB持留生存机制是指MTB依靠自身和宿主的特性以及它们之间的相互作用在宿主体内长期存在的方式。该机制会导致结核菌潜伏感染、内燃复发、长期治疗、结核菌耐药性等一系列问题,因此深入研究MTB持留生存机制,查找MTB在宿主体内以非增殖状态存在的本质原因,对于研制抗结核持留菌药物有重要的支撑作用。
2.1 MTB代谢改变 M TB从生长繁殖期进入休眠持留期伴随了某些酶、蛋白质等生物学特性的改变,以适应胞内低氧缺乏营养的环境。首先,MTB改变原有的有氧代谢途径,转向依靠乙醛酸循环支路获取能量和碳源同时降低代谢率,维持其在胞内长期生存的需要。ICL是乙醛酸代谢途径的一个关键酶,对M TB的持留性起着决定性的作用。McK-inney等[5]用敲除了icl基因的MTB感染小鼠的实验证明,敲除株感染小鼠后很快被免疫系统清除,野生株菌负荷指数却一直保持不变,显示出持留性。其次,Cuuningham等[6]用转换电子显微镜和SDSPAGE方法发现无氧条件下MTB细胞壁有增厚,且与16 kD的小热休克蛋白高表达有关,M TB的细胞壁增厚有助于抵抗药物进入细胞内,这也可能是药物对MTB杀伤作用较弱的主要原因。细菌代谢表型的特异性是药物筛选的重要性状之一,深入了解控制代谢表达的基因,对寻找治疗结核持留菌感染的药物靶点有重要的指导作用。
2.2 影响吞噬溶酶体的形成 吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体,是巨噬细胞抗原提呈和清除入侵病原微生物的重要途径。最近研究报道[7-8]吞噬体的成熟是一个内质体与膜蛋白循环过程,M TB吞噬体却可以特异地清除某些重要膜蛋白,使吞噬体不能有效成熟而不能与溶酶体融合。酸性微环境有利于溶酶体酶活性的发挥,但MTB不仅产生NH+4中和吞噬体的酸化,还能抑制质子-ATP酶降低吞噬体的酸化,并使含菌吞噬体与非溶酶体的内质体结合而阻碍吞噬溶酶体的形成[9]。Walburger等[10]还研究到敲除MTB的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶G(pknG)基因或利用特异性抑制剂阻断激酶活性,可有效地促进巨噬细胞内含MTB的吞噬体与溶酶体发生融合,感染的MTB也很快被巨噬细胞杀灭。此外,有毒 MTB细胞壁含量最多的脂质物TDM(T rehalose 6,6-dimycolate)可通过减少吞噬体的酸化和阻碍吞噬溶酶体融合[11],吞噬溶酶体形成受阻,溶酶体中的酶就不能进入含菌吞噬体中作用,MTB就得以存活下来。
2.3 影响巨噬细胞信号传导的活化 巨噬细胞受到刺激时能产生使其活化的信号,获得杀菌活性。γ-干扰素(IFN-γ)是巨噬细胞活化的主要介质,MTB感染的巨噬细胞却对IFN-γ刺激敏感性大大降低[12]。研究表明[13-14],MTB感染诱导巨噬细胞上调表达细胞因子信号传导抑制因子(SCOS)和IL-6参与了这一过程。SCOS通过JAK/STAT信号传导途径抑制IFN-γ的功能,并抑制IFN-γ激活的下游基因表达;IL-6则通过某种不依赖信号传导及转录活化因子l(STAT-1)的途径抑制IFN-γ激活的下游基因表达,并降低未感染的巨噬细胞对IFN-γ刺激的敏感性。MTB的细胞壁大量表达一种含特殊多糖结构的糖基磷酯酰肌醇(GPI)-阿拉伯甘露糖(LAM),LAM能插入巨噬细胞细胞膜上富含GPI的区域。插入的LAM一方面可改变巨噬细胞的膜表面标记,抑制巨噬细胞向CD4+T细胞呈递抗原的能力,降低CD4+T细胞分泌IFN-γ;另一方面可改变巨噬细胞膜上IFN-γ受体结构,使巨噬细胞对IFN-γ刺激的敏感性降低[15]。同时M TB细胞壁上的一种19X103脂蛋白能以Toll样受体依赖的机制抑制IFN-γ诱导的下游基因表达,抑制巨噬细胞的活化[16]。
2.4 逃避ROI和RNI的杀伤作用 巨噬细胞活化后产生反应氧中间产物(ROI)和反应氮中间产物(RNI)消灭吞入的病原菌。研究发现不能产生ROI的D9变异型巨噬细胞与能正常产生ROI的未变异巨噬细胞对MTB杀伤活性表现一致。应用氧自由基清除剂(如超氧化物歧化酶、触酶等)处理巨噬细胞,其杀结核菌能力也没有明显的变化,由此可知MTB对巨噬细胞产生的ROI有高度的耐受性。耐受机制可能是:MTB胞壁上的相关糖脂及菌体分泌的糖脂均有高效的氧自由基清除作用,可抑制巨噬细胞的呼吸爆发的杀伤;MTB产生的蛋白过氧化氢酶-过氧化物酶(KatG)具有锰离子依赖的过氧化物酶活性、细胞色素P450样的加氧酶活性及过氧亚硝酸酶活性,在MTB抵抗ROI及RNI杀伤中起重要作用;MTB降低巨噬细胞的细胞色素C氧化酶的表达,抑制了呼吸爆发,因为此酶是电子传递链终末环节的酶,从而逃避了杀伤[17]。
2.5 降低巨噬细胞的凋亡率 Balcewicz-Sablinska等分别用减毒株H37Ra和有毒株H37Rv感染巨噬细胞,并检测2者诱导巨噬细胞凋亡的差异,发现前者明显高于后者。进一步研究发现H37Rv感染组可溶性TNF-α受体-2(sTNFR-2)的水平明显升高,且在H37Ra感染组培养液中外源加入sTNFR-2可使该组巨噬细胞的凋亡水平降至H37Rv感染组相一致的水平。因此可知MTB通过诱导sTNFR-2的表达上调来抑制巨噬细胞的凋亡作用[18]。同时H37Rv还能诱导巨噬细胞凋亡抑制因子Mcl-l的表达上调,和/或降低了巨噬细胞表面Fas的表达水平,减少巨噬细胞的凋亡[19-20]。另外,M TB胞壁的LAM也可通过 cAMP抑制剂等抑制细胞发生凋亡[21]。巨噬细胞凋亡率的下降保存了持留菌赖以生存的环境,是MTB持留生存过程中的重要步骤。将提高巨噬细胞的凋亡率作为杀灭持留菌的一个治疗靶标具有一定的研究意义。
2.6 MTB持留的基因控制机制研究 MTB基因者组全序列的阐明及分子生物学技术的发展为阐明MTB持留现象的分子机制提供了有效的手段,研究发现MTB进入巨噬细胞后存在特殊的基因表达以适应胞内环境。至今主要有sigF,Msr,PcaA,PE家族等基因的研究。近期还发现 relA基因可调控细菌的缓慢生长,诱导MTB进入休眠持留状态,Dahl等[22]用实验作了进一步证明,并了解到relA基因主要调节了另2个与持留相关的hspX基因和eis基因的表达。hspX基因是能够调节MTB进入休眠持留状态的DosR蛋白的一个调节因子[23]。eis基因由于具有提高MTB在巨噬细胞中生存能力的作用而且特异性表达于致病的MTB复合群引起了人们特别关注[24]。当外周血淋巴细胞受到Eis抗原的刺激时,以Th2型细胞分泌IL-10的细胞免疫为主,活动性肺结核患者对Eis抗原的细胞免疫水平低下,经抗结核治疗康复后细胞免疫维持在较高水平[25],而Th2型免疫反应则与感染的进展、持续和慢性化有关[26]。基因芯片技术为研究生长繁殖期和静止持留阶段MTB的基因表达差异提供了方便,但是确定哪些或者哪一个特定基因从本质上调控了MTB持留性,有待进一步的实验证实。
3 针对结核持留菌的治疗现况
现有的抗结核药物对持留性MTB的杀伤作用非常弱,这也是抗结核化疗时间较长的主要原因,过长的疗程也极易导致耐药菌的产生。研发抗结核持留菌药物能明显缩短治疗周期,防止结核病内燃复发,降低耐药菌产生机率,具有重要的临床意义。针对抗结核持留菌药物研究大致可从3方面入手:(1)消灭MTB在药物敏感的增值状态阻止其进入持留进程;(2)将MTB持留菌杀死在持留状态;(3)使其复活进入药物敏感状态然后消灭它。
甲硝唑是研究较早的1个抗结核持留菌的药物,Wayne等[27]利用逐渐降低培养环境中氧浓度的方法诱导的结核持留菌模型来检测一定剂量的异烟肼、利福平、甲硝唑的抗结核效应,发现甲硝唑降低集落刺激单位(CFU)作用最明显。但是甲硝唑对MTB的杀灭作用有一定的限制,故在临床上应用较少[28]。另一药物硝基咪唑并吡喃类(NAPs)化合物PA-824对低氧环境下培养的非复制期结核分枝杆菌模型有长期的杀菌作用,其活性类似于甲硝唑[29],现已进入临床试验阶段。
异柠檬酸裂合酶(ICL)是MTB胞内厌氧代谢的关键酶,将ICL作为抗结核持留感染的药物作用靶点,达到消灭宿主体内结核持留菌的目的,是最近国内外研究的一个热点。体外具有活性的ICL抑制剂溴3-丙酮酸和3-硝基丙酸盐正在筛选试验研究中[30],针对该靶点的新的药物也在积极的研发。同时国内学者还深入开展中药的抗结核研究,詹莉等[31]报道了中药猫爪草(小毛莨内酯)可能通过促进宿主细胞颗粒裂肽mRNA的表达,增强机体CTL杀菌能力,达到抗结核持留菌的作用。尽管中药成分多,作用机制复杂,但随着现代技术的发展,研发抗结核持留性的中药复方制剂将有一定的前景。
4 结语
通过上面的阐述我们可以看出,目前虽然关于结核持留方面的研究很多,而这些研究结果也确实显示与MTB持留生存相关,但是至今我们还没有得到最清晰的MTB持留生存的机制,这也是为什么现在还未找到治疗结核菌持留感染的方法的关键所在。MTB能够在宿主体内持留生存或许是由多方面的因素决定的,但是也有可能存在某一关键因素,找到这一关键因素对控制和根除结核病将是一个重大的突破,随着分子生物学技术的发展,基因水平的研究将是解决这一难题的一个重要突破口。
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重庆医科大学科技创新基金资助项目(XB200512)
李升锦(lsj1025@163.com)
2009-03-30)
(本文编辑:张晓进)