表面活性剂在脱落细胞免疫细胞化学技术中的应用

康筱玲,李 伟,冉志远

随着免疫组织化学技术的不断发展,免疫脱落细胞学在临床病理诊断中的应用也越来越广泛。但在常规的脱落细胞学检查中,常因免疫细胞化学染色阳性率低、非特异性着色等问题,导致免疫细胞化学染色结果不够理想。表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚(T riton X-100)的应用,可以使免疫细胞化学染色的阳性率大大提高,且其非特异性着色显著降低,有利于阳性结果的判断,并且节约抗体,现将具体方法介绍如下。

1 材料与方法

1.1 病例采集 收集海军总医院病理科2007-2009年经细胞病理学检查确诊为恶性胸水及恶性腹水标本共27例,标本及时离心,固定制成涂片,95%乙醇中备用。

1.2 试剂 Triton X-100溶液,实验用第一抗体测定增殖细胞核相关抗原(ki-67)、癌胚抗原(CEA)、白细胞共同抗原(LCA)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 质量分数 Triton X-100溶液用0.01 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)配制成1%及0.3%质量分数的溶液。

1.4 抗体稀释 ki-67为1∶100,CEA为1∶100,LCA 为1∶100。

2 实验设计

2.1 分组 27例胸腹水标本随机分为A、B、C组,A组滴入ki-67,B组滴入CEA,C组滴入LCA。

2.2 实验步骤

2.2.1 预处理 涂片蒸馏水冲洗3次,A、B组浸泡于1%T riton X-100 20 min,C组浸泡于PBS 20 min,PBS冲洗3次。

2.2.2 消除内源性过氧化物酶 3%H2O2溶液浸泡涂片10 min,PBS冲洗3次。

2.2.3 修复 pH 6.0枸橼酸盐修复液,高压锅修复2.5 min,PBS冲洗3次。

2.2.4 滴加一抗 A、C组加入一抗,B组加入比例为2∶1的一抗与0.3%Triton X-100混合液。

2.2.5 孵育 37℃温箱孵育2 h,PBS冲洗3次。

2.2.6 加入二抗 3组加入通用型二抗,37℃温箱孵育30 min,PBS冲洗3次。

2.2.7 显色 3,3-二氨黄联苯胺(diaminobe nzidine,DAB)显色。

苏木素复染、脱水、透明、封片,显微镜下观察。

3 结果

3.1 判断标准 ki-67以细胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性。CEA以细胞膜或细胞浆染成棕黄色或棕褐色为阳性。LCA以细胞膜染成棕黄色或棕褐色为阳性。

3.2 结果判读 A组与B组相比,细胞的阳性率表达基本一致,但B组较A组背景明显清晰,且特异性着色深。C组细胞阳性率明显低于A、B组。B组细胞之间排列较A组及C组整齐,且没有成团簇拥的现象。

4 讨论

脱落细胞的免疫细胞化学与组织切片相比,有标本新鲜、操作方便快捷、勿需石蜡高温处理及细胞抗原性保存较好的优点,可在实际工作中应用[1]。但其缺点是细胞离心或涂片后黏着度较差、易掉片、非特异性沾染强、涂片面积大、耗费试剂多及标本制作重复性差等,不像免疫组织化学那样常规开展[2]。脱落细胞胞膜较完整,抗体进入细胞内速度较慢,脱落细胞抗体作用时间较组织切片时间长,因此脱落细胞免疫组化要求的抗体浓度比组织切片相比要高[3]。T riton X-100是一种表面活性剂,能溶解脂质,增加细胞膜的通透性,有利于抗体较快深入细胞内部,从而缩短抗体作用时间并能增强阳性细胞染色结果。将涂片泡在T riton X-100溶液中进行预处理,并在滴加一抗时在抗体中混入低浓度的T riton X-100溶液,既能增加涂片中阳性细胞表达,减少非特异性着色、降低背景,又能节省抗体,是一种较好的脱落细胞免疫细胞化学方法。

[1]张智慧,孙耘田.免疫细胞化学在细胞病理学中的应用[J].中华病理学杂志,2005,34(10):672-673.

[2]熊正文,王伯法,史景泉,等.微波修复抗原技术在免疫细胞化学染色中的应用现状[J].临床与实验病理学杂志,1998,14(2),177-179.

[3]潘琳,高福云,郭艳茹.脱落细胞免疫细胞化学技术[J].中华病理学杂志,2007,36(7):491-493.