LPS活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞VEGF及ZO-1表达的影响

廖宇洁 邬海翔 徐格致 张萌 樊嘉雯 蒋婷婷 王文韬

视网膜小胶质细胞作为视网膜的免疫细胞，可以有多种状态，执行多种功能[1]，其数量和形态可发生变化，合成并释放多种细胞因子、炎性反应趋化因子以 及神经营养因子等[2]，影响疾病的发生发展过程。近年来关于视网膜小胶质细胞在视网膜神经元变性疾病中作用的研究较多，但对于小胶质细胞与血管疾病的关系所知甚少。本文探索性地研究活化的视网膜小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和ZO-1表达的影响，以初步了解活化的小胶质细胞是否可能影响屏障功能。

1 材料与方法

1.1 材料 出生2～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠(雌雄不限，符合国家医用动物使用标准，清洁级)，购自中国科学院。0.25%胰酶加0.02%依地酸二钠，多聚D赖氨酸和4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐购自美国Sigma公司。Hank’s平衡盐液(Hank′s balanced salt solution ，HBSS)和胎牛血清购自美国Gibco公司。CD68和聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)为美国Millipore公司产品。HUVECs和内皮细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)购自美国ScienCell公司。达尔伯克改良伊格尔培养基混合营养素F12(Dulbecco′s modified eagle medium: nutrient mixture F-12，DMEM/F12)为美国Hyclone公司产品。细胞培养瓶、Transwell小室和24孔板购自美国Corning公司。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、ZO-1和羊抗鼠二抗购自美国Invitrogen公司。VEGF为英国Abcam公司产品。BCA蛋白浓度测定试剂盒、电泳液和转膜液购自碧云天生物技术研究所。主要仪器为化学发光影像分析仪LAS4000 和Leica荧光显微镜。

1.2 方法

1.2.1 小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 参照文献[3-4]的方法。出生2～3 d的清洁级SD大鼠断头处死，碘伏浸泡5 min，无菌条件下取出眼球，在预冷的无钙镁的HBSS中漂洗3次，取出视网膜并剪碎，加入0.25%胰酶加0.02%依地酸二钠37 ℃消化20 min，用含10%体积分数胎牛血清的DMEM/F12终止消化，过200目细胞筛，滤液置于无菌离心管200 ×g离心5 min，弃上清液，细胞重悬并以1×106/mL接种于多聚D赖氨酸包被过的细胞培养瓶,置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养。3 d后换液，之后每3～4 d加液。14 d时将细胞培养瓶置于恒温摇床，以20 g/min的速度振摇1 h，收集上清液，200×g离心10 min,沉淀物重新混悬，接种于24孔板，2 h后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗去未贴壁的细胞，4%多聚甲醛固定15 min,TritonX-100膜穿孔,PBS清洗后用牛血清白蛋白封闭30 min,加入一抗4 ℃湿房过夜，CD68为1∶200,PBS洗3次后加入羊抗鼠二抗37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，加入DAPI 2 min，PBS清洗，滴甘油，封片。Leica荧光显微镜观察。

1.2.2 HUVECs的复苏和传代 液氮中取出HUVECs后37 ℃水浴迅速复温，用ECM培养24 h后换液，之后每3 d消化传代，第4～10代细胞用于实验。

1.2.3 小胶质细胞和HUVECs共培养 小胶质细胞接种于Transwell的上室，2 h后PBS洗去未贴壁的细胞，分别用不含血清的DMEM/F12和不含血清但含100 ng/mL LPS的DMEM/F12培养小胶质细胞24 h，PBS洗2次后用于实验。A组仅在下室接种HUVECs,上室无小胶质细胞，B组上室为未激活的小胶质细胞，下室为HUVECs，C组上室为100 ng/mL的LPS激活的小胶质细胞，下室为HUVECs。共培养24 h后进行HUVECs细胞免疫荧光染色观察ZO-1的表达,并行Western Blot检测VEGF 和ZO-1蛋白量。

1.2.4 ZO-1表达的观察 小胶质细胞和HUVECs共培养24 h后，A、B和C组的HUVECs用PBS清洗后行细胞免疫荧光染色，方法和小胶质细胞鉴定相同，一抗ZO-1为1∶100，对照为PBS代替一抗。

1.2.5 VEGF和ZO-1蛋白量的测定 移去上室，HUVECs用无钙镁的HBSS洗2次，加入裂解液用细胞刮刀刮下细胞并收集，置于冰上20 min，4 ℃，13 000×g离心10 min,取上清液备用。BCA法蛋白定量，取上清液按体积比加入5×上样缓冲液,99 ℃×3 min蛋白变性。各组取蛋白样品行SDS-PAGE电泳，将蛋白用湿转法转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h,加入一抗，VEGF为1∶1 000，ZO-1为1∶500，4 ℃过夜，洗膜，分别加入羊抗鼠和羊抗兔二抗，孵育1 h,再洗膜后用化学发光影像分析仪LAS4000获取图片结果。

1.2.6 统计学处理 实验结果采用Stata7.0软件统计数据，进行方差分析，并两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

静息的小胶质细胞胞体小，部分细胞胞膜上有微小突起(见附1页图①和图②)；LPS激活的小胶质细胞胞体增大，突起明显增多(见附1页图③和图④)。 A组HUVECs紧密连接蛋白ZO-1主要集中在相邻细胞的边界(见附1页图⑤)，B组HUVECs的ZO-1也集中于相邻细胞之间，但表达略降低(见附1页图⑥)；C组HUVECs的ZO-1表达明显减弱，连续性中断(见附1页图⑦)。免疫印迹检测VEGF和ZO-1蛋白量变化，蛋白表达值以β-actin内参校正，结果显示三组细胞的ZO-1和VEGF蛋白表达不全相同，差异有统计学意义(P<0.05，F值分别21.2及9.28),C组与A组和B组比较，VEGF蛋白的表达上调(P<0.05，F值分别为0.075及0.061)(见附2页图⑧)，ZO-1蛋白的表达下调(P<0.05，F值分别为0.12及0.07) (见附2页图⑨)。A组和B组比较，ZO-1和VEGF蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05，F值分别为0.04及0.013)。静息的小胶质细胞胞体小，部分细胞胞膜上有微小突起(见附1页图①和图②)；LPS激活的小胶质细胞胞体增大，突起明显增多(见附1页图③和图④)。 A组HUVECs紧密连接蛋白ZO-1主要集中在相邻细胞的边界(见附1页图⑤)，B组HUVECs的ZO-1也集中于相邻细胞之间，但表达略降低(见附1页图⑥)；C组HUVECs的ZO-1表达明显减弱，连续性中断(见附1页图⑦)。免疫印迹检测VEGF和ZO-1蛋白量变化，蛋白表达值以β-actin内参校正，结果显示三组细胞的ZO-1和VEGF蛋白表达不全相同，差异有统计学意义(P<0.05，F值分别21.2及9.28),C组与A组和B组比较，VEGF蛋白的表达上调(P<0.05，F值分别为0.075及0.061)(见附2页图⑧)，ZO-1蛋白的表达下调(P<0.05，F值分别为0.12及0.07) (见附2页图⑨)。A组和B组比较，ZO-1和VEGF蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05，F值分别为0.04及0.013)。

3 讨 论

小胶质细胞是中枢神经系统的免疫效应细胞，在神经变性疾病中起着介导神经元损伤的作用，视网膜神经元变性疾病如青光眼[5-6]、视网膜色素变性[7]和光感受器损伤[8]等的发生发展均与视网膜小胶质细胞有着千丝万缕的联系，因此视网膜小胶质细胞和视网膜神经元变性疾病之间关系的研究是近年眼科研究的热点之一。那么在视网膜血管疾病中小胶质细胞起作用吗？在对年龄相关性黄斑变性疾病研究中发现活化的小胶质细胞通过促进VEGF表达上调等作用参与了脉络膜新生血管的形成[9]。最新的对糖尿病视网膜病变患者尸体眼的病理研究中发现，在非增殖期和增殖期糖尿病视网膜病变的各个阶段都可见活化状态的小胶质细胞，而且这些小胶质细胞聚集在视网膜微血管病变的周围[10]，其作用不知。本研究显示，LPS活化的小胶质细胞可以引起HUVECs的VEGF表达上调，ZO-1表达下调，可能影响屏障功能。

血视网膜屏障的破坏与视网膜血管疾病的发生发展密切相关，可引起血管的渗漏和视网膜水肿。内层血视网膜屏障的功能与视网膜内皮细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)构成相关，血管内皮紧密连接的特定蛋白的解体会造成内层血视网膜屏障的破坏。ZO-1是最早发现的TJ蛋白，存在于多种器官的血液屏障中，ZO-1蛋白表达异常会直接导致TJ破坏，屏障功能受损[11-12]。另外，VEGF也是公认的影响血视网膜屏障功能的细胞因子。因此，我们将ZO-1和VEGF 作为检测指标来了解小胶质细胞对屏障功能的可能影响。本研究发现，当HUVECs与小胶质细胞共培养时，活化状态的小胶质细胞作用于HUVECs使VEGF表达上调，且 ZO-1的表达下调，而空白对照组几乎无作用。说明活化的视网膜小胶质细胞可以通过促进VEGF表达的上调和ZO-1表达的下调破坏屏障功能。小胶质细胞易受微环境影响，可以有多种状态并执行多种功能，因此对于其在血管病变致病机制中的作用有待进一步深入研究。

[1]LYNCH M A.The multifaceted profile of activated microglia[J].Mol Neurobiol,2009,40(2)：139-156.

[2]HANISCH U K,KETTENMANN H.Microglia:active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain[J].Nat Neurosci,2007,10(11):1387-1394.

[3]ROQUE R S,CALDWELL R B.Isolation and culture of retinal microglia[J].Curr Eye Res,1993，12(3):285-290.

[4]王爱玲，柳林，朱秀安，等.视网膜小胶质细胞活化模型的建立[J].北京大学学报(医学版)，2005，37(2)：198-200.

[5]NEUFELD A H.Microglia in the optic nerve head and the region of parapapillary chorioretinal atrophy in glaucoma[J].Arch Ophthalmol,1999,117(8):1050-1056.

[6]岳红云，贺翔鸽，燕振国.慢性高眼压SD大鼠视网膜小胶质细胞CD11b表达研究[J].中华眼科杂志，2009，45(4)：356-360.

[7]曾惠阳，曹安民，朱秀安.小胶质细胞在人原发性视网膜色素变性中的活化[J].眼科研究，2008，26(2)：129-132.

[8]NI Y Q,XU G Z,HU W Z,et al.Neuroprotective effects of naloxone against light-induced photoreceptor degeneration through inhibiting retinal microglia activation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(6):2589-2598.

[9]MA W，ZHAO L,FONTAINHAS A M,et al.Microglia in the mouse retina alter the structure and function of retinal pigmented epithelial cells: a potential cellular interaction relevant to AMD[J].PLoS One,2009,4(11):e7945.

[10]ZENG H Y,GREEN W R,TSO M O.Microglial activation in human diabetic retinopathy[J].Arch Ophthalmol,2008，126(2):227-232.

[11]唐宇平，蔡定芳，刘军，等.急性脑出血血肿周围组织水通道蛋白-4表达与血脑屏障损伤的关系[J].中华神经科杂志，2005，38(11)：704-708.

[12]陈振勇,冯贤松,周有生.梗阻性黄疸大鼠肠黏膜上皮紧密连接蛋白和MLCK的研究[J].中国普通外科杂志，2008，17(2)：140-144.