闪式提取法提取丹参中有效成分的研究

于 敏， 韩德强

(佳木斯大学化学与药学院，黑龙江省生物药制剂重点实验室，黑龙江佳木斯154007)

丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。丹参主要有效成分为水溶性酚酸类(丹参素、原儿茶醛及丹酚酸)、脂溶性二萜醌类(丹参酮和丹参醌)，传统的丹参有效成分提取工艺，如水煎法、水醇法、乙醇回流法、超声波法。本实验以丹参酮ⅡA和原儿茶醛为指标成分，通过闪式提取法对丹参进行提取，采用正交试验法对影响丹参提取工艺的主要因素进行了考察，并采用高效液相色谱法对指标成分进行含量测定，确定出最佳提取工艺，为丹参制剂的前处理提供实验依据。

1 仪器与试剂

Agilent 110型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，JHBC－50S闪式提取器(北京市金鼐科技发展有限公司);UV/Vis－WC1型褶合光谱仪(上海玉田分析仪器公司);R206型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所，批号110766－200417);原儿茶醛对照品(中国药品生物制品检定所，批号110810－200506);丹参为市售(佳木斯市药材公司);鉴定为唇形科植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)的干燥根及根茎;色谱纯甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

根据文献［2～4］及单因素实验，选取影响提取物收率的浸泡时间(A)，提取时间(B)，提取电压(C)为考察因素，以丹参酮ⅡA和原儿茶醛的含量为考察指标，确定因素水平如表1。

2.2 试验方法

称取丹参药材粗粉9份，各25 g，按L9(34)正交试验，先用15倍量95%乙醇浸泡3 h，闪式提取后，再用15倍量水浸泡1 h进行提取，提取液过滤，合并，浓缩，定容至100 mL。

表1 因素与水平表

2.3 丹参酮ⅡA含量测定方法

2.3.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇－水(83 ∶17)，流速:1.0 mL/min，检测波长:270 nm。

图1 丹参酮ⅡA对照品的HPLC图

图2 丹参酮ⅡA样品的HPLC图

2.3.2 供试品溶液的制备 精密吸取正交试验溶液各10 mL，加95%乙醇定容至100 mL，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.3.3 对照品溶液制备 取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加95%乙醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.3.4 标准曲线绘制 标准曲线的绘制分别精密吸取对照品溶液(41.00 μg/mL)5、10、15、20、25 μL，注入液相色谱仪，以对照品进样量对峰面积作图，计算得回归方程:Y=4 723.8X－263.97，r=0.999 6，说明丹参酮ⅡA对照品在0.205～1.025 μg范围内有较好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液15 μL，进样按含量测定项下色谱条件测定，连续测定5次峰面积，结果表明:精密度RSD=1.71%，精密度较高，说明本方法用于测定丹参酮ⅡA比较稳定。

2.3.6 样品稳定性试验 取第5组样品，分别在0，2，6，8，10 h进行测定，每次进样10 μL，考察样品溶液的稳定性。结果RSD为0.91%，说明本溶液在10 h内具有良好稳定性。

2.3.7 加样回收率试验 吸取一定量已知含量的提取液，加入一定量丹参酮ⅡA对照品，制备成5份样品，按前述条件进行含量测定，平均加样回收率为100.8%，RSD为1.01%，回收率较高，方法可靠。

2.3.8 测定法 精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积A，将峰面积代入标准曲线方程，得到进样量。则含量计算方法如下:

结果见表2，方差分析见表3。

2.4 原儿茶醛含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇－水－冰醋酸(18 ∶89 ∶1)，流速:1.0 mL/min，检测波长:280 nm。

图3 原儿茶醛对照品HPLC图

图4 原儿茶醛样品HPLC图

2.4.2 供试品溶液的制备 精密吸取正交试验溶液各10 mL，加50%乙醇定容至 50 mL，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.4.3 对照品溶液制备 取原儿茶醛对照品适量，精密称定，置量瓶中，加水制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.4.4 标准曲线绘制 分别精密吸取对照品溶液5、10、15、20、25 μL，分别注入液相色谱仪，以对照品进样量对吸收峰面积作图，计算得回归方程:Y=6 629.1x－148.19，r=0.999 7，表明原儿茶醛对照品在0.2～1.0 μg范围内有良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液15 μL，进样按含量测定项下色谱条件测定，连续测定5次峰面积，结果表明:精密度RSD=1.19%，精密度较高，说明本方法用于测定原儿茶醛比较稳定。

2.4.6 样品稳定性试验 取第5组样品，分别在0，2，6，8，10 h进行测定，每次进样20 μL，考察样品溶液的稳定性。结果RSD为0.75%，说明本溶液在10 h内具有良好稳定性。

2.4.7 加样回收率试验 吸取一定量已知含量的提取液，加入一定量原儿茶醛对照品，制备成5份样品，按前述条件进行含量测定，平均加样回收率为101.4%，RSD为1.05%，回收率较高，方法可靠。

2.4.8 测定法 分别精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积A，将峰面积代入标准曲线方程，得到进样量Mμg。则含量计算方法如下:

含量测定结果见表2，方差分析见表4。

表2 L9(34)正交试验结果

由表2直观分析，丹参酮ⅡA的极差RB＞RC＞RA，即对提取影响大小顺序为B＞C＞A，最佳工艺为A3B3C2;原儿茶醛的极差为RC＞RB＞RA，对提取效果的影响顺序为C＞B＞A，最佳工艺为A1B3C3。综合直观分析以及方差分析结果，确定最佳的提取工艺为A3B3C2，即浸泡1.5 h，提取时间60 s，电压 120 V。

表3 丹参酮ⅡA方差分析

表4 原儿茶醛方差分析

2.5 闪式提取与其他提取方法的比较

取5份丹参药材，各50 g，分别用500 mL不同的溶剂浸泡3 h后提取:①水和95%乙醇各加热提取1.5 h;②95%乙醇和水各加热提取1.5 h;③95%乙醇、50%乙醇和水各加热提取1 h;④70%乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h;⑤闪式提取。各合并提取液，过滤，减压浓缩，定容。分别按2.3项和2.4项的方法进行含量测定。结果见表5。

表5 不同提取方法对丹参酮ⅡA和原儿茶醛含量的比较

从上表中可以看出:闪式提取法比其它的一些煎煮法具有更高的提取率。

3 讨论

由方法学研究表明，用HPLC法测定丹参中丹参酮ⅡA和原儿茶醛的准确度和灵敏度较高，实验操作相对简单，适用于本文的研究。

丹参作为临床常用中药，提取工艺研究具有较大的实用价值。丹参中以原儿茶醛为代表的丹酚酸是丹参的水溶性成分中主要的有效成分，其性质不稳定，易于氧化。如果用煎煮法提取，则提取时间和温度等影响因素都要加以考虑。闪式提取法则无需考虑这些因素的影响，同时还具有的快速、高效、节省能源和试剂、操作简便等优点［5］，是回流提取法、超声提取法所无法比拟的。丹参中脂溶性成分中丹参酮ⅡA含量较大，丹参酮ⅡA的提取效果也直接影响治疗效果，从试验结果可以看出，闪式提取法对丹参中的脂溶性成分以及水溶性成分均有较高的提取效果，是一种较佳的丹参提取方法。

［1］高玉桂，宋玉梅，杨友义.丹参酮的药理［J］.药学学报，1979，14:752.

［2］郭 姣，何 伟，陈宝田.复方参术调脂胶囊提取工艺的研究［J］.中药材，2006，29(6):598－600.

［3］黄雪梅，蒙大平，邓玉庄.广西苦丁茶老叶的提取工艺研究［J］.中成药，2006，28(1):123－124.

［4］李 蓉，毕 华.复方丹参注射液制备工艺中丹参提取工艺的研究［J］.医学理论与实践，2006，19(6):727.

［5］刘振洋，刘延泽，刘改岚，等.绞股蓝总皂苷的闪式提取和纯化工艺研究［J］. 中草药，2009，40(7):1071－1073.