肺舒通喷雾剂中3种活性成分含量测定

李 媛， 单鸣秋， 张 丽， 丁安伟，2*， 季克胜

(1.南京中医药大学，江苏南京210046;2.江苏省方剂研究重点实验室，江苏南京210046;3.江苏省南通精华制药有限公司，江苏南通226005)

肺舒通是治疗慢性阻塞性肺病的的临床经验方，也是由《太平惠民和剂局方》中三拗汤加味而得［1］。肺舒通喷雾剂是由金荞麦、丹参、苦杏仁、麻黄、甘草五味中药制成的复方制剂，方中君药金荞麦解毒清肺以祛外邪，臣药丹参活血化瘀以通肺络，具有解毒化瘀，宣肺平喘的功效，临床用于外邪侵扰、痰瘀阻肺的慢性阻塞性肺病，为了控制肺舒通喷雾剂的质量，保证临床疗效，本实验采用高效液相色谱法分别测定(-)-表儿茶素、丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量，对制剂中3种成分分别进行定量分析。该方法分离效果好、灵敏、准确，可达到较好的控制产品质量的目的。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-10A型高效液相色谱仪(SPD-10A型检测器)，Sartorius BP211D电子天平(精确度为十万分之一)，RE-52A型旋转蒸发仪(上海荣华生化仪器公司)。

1.2 药品与试剂 (-)-表儿茶素(中国药品生物制品检定所，110878-200102)，丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所，批号110766-200518)，丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，111562-200807)，聚酰胺(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂，20070123)，乙腈、甲醇均为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂为分析纯。肺舒通喷雾剂(批号为200901、200902、200903，自制)。

2 方法学考察

2.1 色谱条件

(-)-表儿茶素:Symmetry shield RP C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相为0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈(9 ∶1)，流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为40℃，进样量为10 μL。在此色谱条件下，(-)-表儿茶素与其它成分分离良好。见图 1、2。

图1 (-)-表儿茶素对照品HPLC色谱图

图2 (-)-表儿茶素供试品HPLC色谱图

丹参酮ⅡA［2］:Symmetry shield RP C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相(A)∶甲醇-水(75∶25);检测波长:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:35℃，进样量:10 μL。在此色谱条件下，丹参酮ⅡA与其它成分分离良好。见图3、4。

图3 丹参酮ⅡA对照品HPLC色谱图

图4 丹参酮ⅡA供试品HPLC色谱图

丹酚酸 B［2］:Symmetry shield RP C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相(B):甲醇-乙腈-水-甲酸(30∶10∶59∶1);检测波长:286 nm;流速:0.8 mL/min;柱温:35 ℃，进样量:10 μL。在此色谱条件下，丹酚酸B与其它成分分离良好。见图5、6。

图5 丹酚酸B对照品HPLC色谱图

图6 丹酚酸B供试品HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取(-)-表儿茶素对照品2.79 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

精密称取丹参酮ⅡA对照品2.05 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

精密称取丹酚酸B对照品5.02 mg，置10 mL棕色量瓶中，加流动相(B)稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品0.5 mL，置5 mL量瓶中，加水稀释至刻度。经聚酰胺(10 mL湿体积)纯化，50 mL水洗脱，弃去水洗液，95%乙醇60 mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，挥去乙醇，用乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液水(1∶9)洗净残渣，置5 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，即得(-)-表儿茶素供试品溶液。

精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加流动相(A)稀释至刻度，摇匀。从中吸取1 mL，置5 mL量瓶中，加流动相(A)稀释至刻度，摇匀，滤过，即得丹参酮ⅡA供试品溶液。

精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加流动相(B)稀释至刻度，摇匀。从中吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加流动相(B)稀释至刻度，摇匀，滤过，即得丹酚酸B供试品溶液。

2.4 阴性供试品液的制备

取以处方比例及制备工艺制得不含金荞麦和丹参的样品，按2.3项供试品溶液的制备方法制备，即得阴性供试品溶液。结果表明，阴性供试品溶液对(-)-表儿茶素、丹参酮ⅡA和丹酚酸B的测定无干扰。见图7～9。

图7 (-)-表儿茶素阴性供试品HPLC色谱图

图8 丹参酮ⅡA阴性供试品HPLC色谱图

2.5 线性关系的考察

精密量取(-)-表儿茶素对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得27.900 0 μg/mL对照品溶液，采用逐级稀释法配成13.950 0、6.975 0、3.487 5、1.743 8 μg/mL一系列浓度的对照品溶液。

图9 丹酚酸B阴性供试品HPLC色谱图

精密量取丹参酮ⅡA对照品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得8.200 0 μg/mL对照品溶液，采用逐级稀释法配成4.100 0、2.050 0、1.025 0、0.512 5 μg/mL 一系列浓度的对照品溶液。

精密量取丹酚酸B对照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加流动相(B)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100.400 μg/mL对照品溶液，采用逐级稀释法配成50.200、25.100、12.550、6.275 μg/mL 一系列浓度的对照品溶液。

在上述色谱条件下，分别进样10 μL，每个浓度进2针，记录峰面积。以平均峰面积(Y)为纵坐标，对照品溶液浓度(X，μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。(-)-表儿茶素回归方程为 Y=13 081.4X－1 360.2(r=0.999 9)，丹参酮ⅡA回归方程为Y=53 975X+4 658.7(r=0.999 8)，丹酚酸B回归方程为Y=16 917X－36 766.4(r=0.999 8)。结果表明(-)-表儿茶素在 1.743 8 ～27.900 0 μg/mL、丹参酮ⅡA在 0.512 5～8.200 0 μg/mL、丹酚酸 B 在6.275～100.400 μg/mL的范围内线性关系良好。

2.6 实验方法学考察

2.6.1 精密度试验 取(-)-表儿茶素对照品溶液(浓度为13.950 0 μg/mL)、丹参酮ⅡA对照品溶液(浓度为 4.100 0 μg/mL)和丹酚酸 B(浓度为50.200 μg/mL)，分别连续进样 6 次，每次 10 μL，记录峰面积。(-)-表儿茶素峰面积平均值为180 237(RSD=2.91%);丹参酮ⅡA峰面积平均值为39 046.2(RSD=2.49%);丹酚酸B峰面积平均值为825 144.8(RSD=0.90%)。

2.6.2 重复性试验 取批号为200901本品6份，按2.3项供试品溶液的制备方法制备，照上述色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积。以平均峰面积按照标准曲线法计算得(-)-表儿茶素、丹参酮ⅡA和丹酚酸B的平均含量分别为193.2 μg/mL(RSD=0.51%)、202.7 μg/mL(RSD=1.12%)和5 604.8 μg/mL(RSD=0.16%)。

2.6.3 稳定性试验 取重复性试验中第1份溶液，照上述色谱条件分别进样 10 μL，在 0、1、2、4、6、8 h测定，记录峰面积，(-)-表儿茶素峰面积平均值为254 691(RSD=0.84%)，丹参酮ⅡA峰面积平均值为232 185(RSD=2.68%)，丹酚酸B峰面积平均值为1 001 606(RSD=1.46%)。结果表明，供试品溶液在8 h内稳定。

2.6.4 加样回收率试验 取批号为200901本品，精密量取6份，每份0.25 mL，分别精密加入(-)-表儿茶素对照品溶液(6.975 0 μg/mL)0.25 mL，置5 mL量瓶中，按2.3项下供试品溶液的制备方法制备。每份进样两次，每次10 μL，记录峰面积，以平均峰面积按照标准曲线法计算平均加样回收率。见表1。

表1 (-)-表儿茶素加样回收率实验结果(n=6)

取批号为200901本品，精密量取6份，每份0.5 mL，丹参酮ⅡA和丹酚酸B对照品溶液(2.050 0 μg/mL和 50.200 μg/mL)0.5 mL，置 50 mL 量瓶中，按2.3项下供试品溶液的制备方法制备。每份进样两次，每次10 μL，记录峰面积，以平均峰面积按照标准曲线法计算平均加样回收率。见表2、3。

表2 丹参酮ⅡA加样回收率实验结果(n=6)

表3 丹酚酸B加样回收率实验结果(n=6)

2.7 样品含量测定 取3个批号的样品，依2.3项供试品溶液制备方法分别制得供试品溶液。按2.1项色谱条件分别进样10 μL，记录峰面积，以平均峰面积按照标准曲线法计算含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

金荞麦为肺舒通喷雾剂君药，主要含有(-)-表儿茶素［3］等黄烷醇类代表化合物，丹参为方中臣药，水溶性部分主要为酚性酸类化合物［4］包括丹参素、原儿茶醛、丹酚酸等，主要含有丹酚酸B［5］酚酸类及丹参酮类化合物。本实验结合2005版中国药典一部相关要求，以金荞麦主要有效成分(-)-表儿茶素和丹参的主要有效成分丹参酮ⅡA和丹酚酸B作为指标成分进行含量测定，从而更好更全面地控制肺舒通喷雾剂的质量。

本实验在初期进行预实验及条件筛选时，曾考虑采用梯度洗脱结合DAD检测器同时测定此3种成分，但是由于三者之间化学性质和含量差异较大，而且前处理方法各有差异，遂采用目前分别测定含量的方法。

［1］袁飞龙，张 丽，丁安伟.中药复方治疗慢性阻塞性肺病的研究进展［J］.中国药业，2008，17(16):15-17.

［2］中国药典［S］.一部.2005:52-53.

［3］郑瑞霞，杨峻山.黄烷醇类化合物及其药理活性［J］.国外医药·植物药分册，2005，20(2):58-61.

［4］付辛芳，刘晓红.丹参的药理作用与临床应用研究进展［J］.中国药师，2006，15(1):76-77.

［5］贾 娜，项海芝，杨松松.丹参水溶性部分丹酚酸的进展述评［J］. 辽宁中医学院学报，2006，8(3):41-42.