HPLC-PDA测定银屑灵流膏中5种成分含量

陈有军， 赵瑞芝， 赵 莹， 卢传坚

(广州中医药大学第二临床医学院，广东广州510006)

银屑灵为广东省中医院的医院制剂，处方来源于广州中医药大学名老中医禤国维教授。由当归、赤芍、川芎、金粟兰、土茯苓、乌梅、甘草等十味药物组成，临床用于治疗银屑病，效果良好。为确保疗效，更好的服务于临床，本实验以HPLC-PDA建立了测定银屑灵流膏中绿原酸、芍药苷、异秦皮啶、阿魏酸和落新妇苷5个成分含量的方法，可用于银屑灵制剂的质量控制。

1 实验部分

1.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪，包括600四元梯度泵、2998 Photodide Arryay Detector、717 plus Autosample和Empower工作站;电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);超纯水机(Milipore公司);离心机(G 20河北省安新县白洋离心机厂);超声仪(BOLONG上海波龙电子设备有限公司)。

1.2 试药与试剂 银屑灵流膏由本实验室自制;绿原酸(110753-200413)、芍药苷(0736-9913)、异秦皮啶(110837-200304)、阿魏酸(0773-9910)均购自中国药品生物制品检定所;落新妇苷购自广州医药工业研究所(批号:0901231);甲醇(天津四友精细化学品有限公司，HPLC级);无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂AR);冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，HPLC级)。

1.3 供试品溶液制备 银屑灵方以水常规提取浓缩后得流膏(含药材2.9 g/mL)，精密量取流膏0.5 mL，加入10倍量的无水乙醇，充分混合使沉淀，3 000 r/min离心5 min，倾取上清液，残渣用无水乙醇洗涤两次，每次1mL，合并醇液，65℃水浴蒸干，残渣以甲醇-0.1%冰醋酸(70∶30)溶液溶解成10 mL，0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液作供试品溶液。

1.4 对照品溶液配制 取绿原酸、异秦皮啶、落新妇苷、芍药苷、阿魏酸适量，精密称定，以甲醇溶解并定容至10 mL，作贮备液。精密量取各标准品贮备液，以甲醇-0.1%冰醋酸(70:30)溶液配制成含绿原酸 10.62 μg/mL、异秦皮啶 3.85 μg/mL、阿魏酸3.28 μg/mL、落新妇苷26.30 μg/mL、芍药苷139.79 μg/mL的混合溶液10 mL作对照品溶液。

1.5 色谱条件 Kromasil 100-5 C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%冰醋酸，0～10 min(10 ∶90～30 ∶70)，10～40 min(30 ∶70～40 ∶60);流速为 1.0 mL/min;绿原酸、异秦皮啶、阿魏酸检测波长为320 nm，落新妇苷为289 nm，芍药苷为230 nm;进样体积10 μL;柱温为室温。

2 结果

2.1 系统适应性 取对照品溶液和供试品溶液，各进样10 μL，记录色谱图，结果5种成分与其它成分均达到基线分离，见图1，图2。

图1 HPLC色谱图(320 nm)A.混合对照品 B.供试品 C.阴性样品(处方中除去当归、川芎、生地、金粟兰、土茯苓、乌梅等含以上成分的药材)1.绿原酸 2.异秦皮啶 3.阿魏酸 4.落新妇苷Fig.1 HPLC chromatogram(320 nm)A.the mixture of chemical reference substance B.sample C.negative sample 1.chlorogenic acid 2.isofraxidin 3.ferulaic acid 4.astilbin

2.2 色谱峰确认 取5种标准品贮备溶液各20 μL，混合后稀释至1 mL，按1.5项色谱条件进样10 μL，记录结果，在所得的色谱图上提取各成分的PDA特征光谱图，并添加到新建的“银屑灵对照品”光谱库。取供试品溶液进样10 μL，将所得的HPLC色谱与“银屑灵对照品”光谱库进行谱库匹配处理，结合保留时间和匹配结果确认样品中的色谱峰。

2.3 线性关系考察 取1.4项下配制的混合对照品溶液，分别进样2.5、5、10、20、30 μL，按2.1 项中的色谱条件测定5种成分的峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并进行回归，计算回归方程，见表1。

2.4 精密度实验 取供试品混合溶液，重复进样6次，每次10 μL，以各物质峰面积计算，RSD值分别为:绿原酸1.77%，异秦皮啶 2.35%，阿魏酸1.62%，落新妇苷1.72%，芍药苷2.35%，表明精密度良好。

图2 HPLC色谱图(230 nm)A.芍药苷对照品 B.供试品 C.阴性样品(处方中除去赤芍)Fig.2 HPLC chromatogram(230 nm)A.peoniflorin reference substance B.sample C.negative sample

表1 线性试验结果Table 1 Results of linear test

2.5 稳定性实验 取同一供试品溶液，室温放置，分别于 0、1.5、5.5、8.5、10、15 h 进样10 μL，测定峰面积，结果RSD值分别为绿原酸3.03%，芍药苷2.86%，异秦皮啶1.80%，阿魏酸1.94%，落新妇苷2.65%，说明供试品在15 h内稳定。

2.6 加样回收实验 精密量取已测定含量的银屑灵流膏9份，每份0.5 mL，分低、中、高3个剂量组分别加入各成分对照品适量，每组3份，按上述样品处理方法处理，测定。计算各剂量组样品的平均回收率和RSD，结果见表2。

表2 5种成分的提取回收率(n=3)Table 2 Recoveries of five components(n=3)

2.7 重复性实验 取同一批样品6份，按上述方法测定，各成分的RSD分别为:绿原酸0.09%，芍药苷1.24%，异秦皮啶0.26%，阿魏酸1.70%，落新妇苷2.46%，说明方法重现性较好。

2.8 样品测定 精密量取3个批次的银屑灵流膏样品每批3份，每份0.5 mL，以上述方法测定，结果见表3。

表3 样品测定结果(n=3)Table 3 Determination results of samples(n=3)

3 讨论

银屑灵处方药味众多，其中的化学成分复杂，成分间性质差异大，为了使各成分达到良好的分离，在方法建立过程中，主要对流动相组成及洗脱方式进行了筛选。我们以甲醇、乙腈、0.1%冰醋酸溶液、0.1%磷酸溶液、0.08%醋酸铵溶液以及水等进行了不同组合的筛选，在洗脱方式上，我们实验了等度及不同梯度对样品分离的比较，结果以甲醇-0.1%冰醋酸梯度洗脱分离较理想，因此最终确定该色谱方法。

基于不同成分紫外吸收特征的不同，为了提高检测灵敏度，在定量时我们采用了物质的最大吸收波长或与之相接近的波长作为检测波长，如芍药苷选择了230 nm用作定量时的波长，落新妇苷选择289 nm，取得了理想的结果。

HPLC法在药物质量控制中的应用非常普遍，但对于成分复杂的样品，在达到较好分离后，由于色谱峰众多，分布密集，tR大多非常接近，单以tR与对照品一致的方法对各成分进行辨识存在较大的不确定性。光电二极管阵列检测器(photodiode array;PDA)是HPLC最常用的检测器之一，该检测器可以获得色谱中各组分的吸收光谱。PDA光谱目前已广泛用于色谱峰的纯度检查、定性分析、选择被测成分最大吸收波长以及建立药物多个特征吸收波长下的指纹图等，大大拓展了PHLC的应用范围［1-3］。本实验在样品测定中采用PDA谱-库匹配处理，以色谱和光谱双重标准对各成分进行了识别与归属，保证了样品中成分的色谱峰光谱与对照品一致，提高了方法的专属性。

4 结论

本实验建立的方法同时测定了银屑灵复方流膏中5种成分，该法方便，准确，重复性好，各成分分离度较好，可用于银屑灵制剂及其中间产品的质量控制。

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