蒙药那如-3丸对佐剂性关节炎的治疗作用及机制

白梅荣， 图 雅， 巴根那， 包晓华

(内蒙古民族大学，蒙医药学院，内蒙古通辽028041)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，病因不明，严重危害着人类的身体健康［1－3］。至今尚无理想的抗类风湿性关节炎药物，开发标本兼治、安全有效的药物有着重要的实际价值。蒙药复方那如－3丸，又称那如苏木珠尔，处方出自《至高要方》，是蒙医临床治疗黄水病的首选方剂。由诃子、制草乌、荜茇配伍组成。味涩辛，性温，具有祛黄水、杀“黏”、消肿、止痛功能，主治关节痛、黄水病、虫病、白喉、炭疽等粘性疾病及腰腿疼痛等［4］，临床效果可佳。本研究就观察那如－3对佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型的治疗作用，并探讨了其可能的作用机制，为将那如－3开发为治疗RA的有效药物提供理论依据和研究基础。

1 实验材料

1.1 实验试剂和药品 弗氏完全佐剂(批号122k8945)，sigma公司产品，由北京拜尔迪公司提供。

雷公藤片(批号040705):三九黄石制药厂产品。

那如－3丸(批号20060113)，由内蒙古民族大学附属医院制剂室制备。

SOD(批号 20080221)、MDA(批号 20080113)、NO(批号 20080310)、IL－1β(批号 20080203)、TNF－a(批号20080126)、PGE(批号20080312)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物 清洁级Wistar大鼠75只，体重为(180±10)g，♀♂兼用;清洁级昆明种小鼠75只，体重为(20±2)g，♀♂兼用。由沈阳医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2003－00160

2 方法及结果

2.1 对大鼠佐剂致继发性足肿胀的影响 取大鼠75只，♀♂兼用，按体重随机分为5组，分别为正常对照组、模型组、那如－3丸大剂量组、那如－3丸小剂量组、雷公藤片组，每组15只。建立模型前用容积法测量各组大鼠左右足容积。除正常对照组外，给各组大鼠右后足足跖皮内注射Freunds完全佐剂0.1 mL致炎。第5天同量再加强注射1次。致炎后第15天开始，各给药组灌胃相应药的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液，正常对照组和模型组灌胃0.5%的羧甲基纤维素钠溶液，给药体积均为2 mL/100 g。每日1次，一直给到第26天。同时观察记录致炎后第12天、15天、18天、21天和24天各组大鼠右后足跖肿胀度，在第1次致炎后第26天依次进行如下处理:

(1)断头取血，在37℃保温30 min，再置4℃冰箱40 min，(2 000 r/min离心10 min，取血清，转移至2 mL具塞塑料离心管中，置超低温冰箱(－45℃)中，备用于测定血清SOD和MDA;

(2)取其右后足关节上1 cm以下部位，剪碎后放入盛有5 mL生理盐水的具塞离心管中，过夜。离心，取上清液，转移至5 mL具塞塑料离心管中，置超低温冰箱(－45℃)中，备用于测定关节组织中IL－1β、TNF－a、PGE 和 NO、SOD、MDA 含量。按照试剂盒说明严格操作，在放射免疫测定仪上测定IL－1β和TNF－a的含量;PGE2按照文献方法进行测定;在紫外－可见分光光度仪上测定NO含量。结果见表1～4。

2.2 对大鼠脾淋巴细胞增殖的影响 佐剂致大鼠继发性关节炎大鼠第一次致炎后第26天断头取血、取关节后，每组随机抽取12只大鼠，无菌操作，打开腹腔取出脾脏，制备大鼠脾细胞悬液，加入96孔培养板，200 μL/孔，使终浓度为 5 ×106/mL，细胞悬液数，每个供试品分装6个孔，其中3孔为对照组不加ConA，另3孔加入 ConA(5 mg/mL)，置37℃，5%CO2培养箱，温育44 h后，每孔加入 MTT(5 mg/mL)继续温育4 h，终止培养，离心(1 500 r/min)5 min，弃去上清液，晾干后加入0.04 mo1/L盐酸异丙醇100 μL，充分混匀，于酶标仪上检测波长570 nm下的吸光度(A值)，以A值表示细胞的增殖反应能力。结果见表5。

2.3 结果

2.3.1 对大鼠佐剂致继发性足肿胀的影响 模型组大鼠足容积自致炎第15天起有明显的肿胀，一直到第24天与正常对照组比较均有显著差异，其中第18天时达高峰。说明佐剂引起的继发性关节炎模型建立成功。各给药组也有不同的肿胀，但第15天至第24天的足容积与模型组比较，明显下降，有显著差异(P＜0.05)。结果见表1。

2.3.2 对大鼠关节组织中白芥素－1β和肿瘤坏死因子－a的影响 与正常对照组相比，模型组关节组织 IL－1β、TNF－a含量明显升高(P ＜0.01)。与模型组相比，那如－3大、小剂量组和雷公藤片组关节组织 IL－1β、TNF－a 含量均明显下降(P ＜ 0.05、P ＜0.01)。结果见表2。

2.3.3 对大鼠关节组织中前列腺素和一氧化氮的影响 与正常对照组相比，模型组关节组织PGE、NO含量明显升高(P＜0.01)。与模型组相比，那如－3丸大、小剂量组和雷公藤片组关节组织PGE、NO含量均明显下降(P＜0.05、P＜0.01)。结果见表3。

2.3.4 对大鼠足关节中超氧化物歧化酶和丙二醛的影响 与正常对照组相比，模型组血清SOD、MDA含量无明显变化，无统计学意义(P＞0.05)。与模型组相比，那如－3丸大、小剂量组和雷公藤片组血清SOD、MDA含量无明显变化，无统计学意义(P＞0.05)。结果见表4。

表1 那如-3丸对大鼠佐剂致继发性足肿胀的影响(±s，n=15)

表1 那如-3丸对大鼠佐剂致继发性足肿胀的影响(±s，n=15)

与模型组比较*P＜0.05。

组别 剂量/(g/kg·d)致炎后不同时间足肿胀率/%12 d 15 d 18 d 21 d 24 d正常对照组模型组那如－3丸大剂量组那如－3丸小剂量组雷公藤片组－－0.4 0.8 0.52 1.33±0.15 1.40±0.11 1.38±0.11 1.37±0.14 1.39±0.13 1.35±0.15*1.53±0.09 1.45±0.10*1.43±0.14*1.46±0.10*1.37±0.15*1.60±0.09 1.51±0.10*1.51±0.13*1.53±0.09*1.39±0.14*1.57±0.10 1.45±0.09*1.45±0.08*1.47±0.09*1.40±0.14*1.56±0.10 1.45±0.09*1.45±0.08*1.47±0.10*

表2 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠足关节中IL-1β、TNF-a的影响(±s，n=14)

表2 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠足关节中IL-1β、TNF-a的影响(±s，n=14)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量/(g/kg·d) 样本数/只 IL－1β含量/(ng/mL) TNF－a含量/(ng/mL)正常对照组 － 14 0.148±0.056** 1.128±0.704**模型组 － 14 0.268±0.172 3.450±1.201那如－3丸大剂量组 0.4 14 0.140±0.043** 2.325±1.097**那如－3丸小剂量组 0.8 14 0.139±0.050** 2.126±1.375**雷公藤片 0.52 14 0.174±0.097** 2.573±2.165*

表3 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠足关节中PGE、NO的影响(±s，n=14)

表3 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠足关节中PGE、NO的影响(±s，n=14)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

NO正常对照组 － 14 0.181±0.063** 14.80±11.87组别 剂量/(g/kg·d) 样本数/只 PGE2**模型组 － 14 0.442±0.089 40.90±24.68那如－3丸大剂量组 0.4 14 0.347±0.055** 21.39±12.68**那如－3丸小剂量组 0.8 14 0.335±0.043** 17.47±10.20**雷公藤片 0.52 14 0.355±0.068** 24.53±9.258*

表4 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠足关节中SOD、MDA的影响(±s，n=14)

表4 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠足关节中SOD、MDA的影响(±s，n=14)

组别 剂量/(g/kg·d) 样本数/只 SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mL)正常对照组 －14 79.27±37.33 3.494±1.340模型组 － 14 69.21±47.89 3.346±0.965那如－3丸大剂量组 0.4 14 72.18±35.38 3.450±0.687那如－3丸小剂量组 0.8 14 63.12±37.04 2.885±0.612雷公藤片0.52 14 78.16±40.03 4.129±0.511

2.3.5 对大鼠脾淋巴细胞增殖的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠脾淋巴细胞增殖能力有所提高，差异显著(P＜0.01)。与模型组相比，各给药组对脾淋巴细胞增殖有抵抗作用，差异显著(P＜0.05)。见表5。

3 讨论

AA是一种免疫性炎症模型，该模型继发性病变表现为以多发性关节炎为特征的全身迟发性超敏反应［5］。为探讨那如－3丸对大鼠AA的治疗作用，于继发性反应出现时开始灌胃给药，结果发现，剂量为0.4、0.8 g/(kg·d)，能够明显抑制继发性足肿胀，对大鼠AA有明显改善作用。

RA是一种全身性异质性自身免疫性疾病，研究表明在RA发病过程中细胞因子网络的失调，即促炎细胞因子(如IL－l、IL－6、TNF－a)和抗炎细胞因子(如 IL－10)的不平衡占有重要地位［6－8］。PGE2可以参与炎症反应;SOD的活性和MDA的水平与脂质过氧化、炎症等机体多种状况有关。因此，测定以上指标对抗类风湿性关节炎药效机制的研究和阐明具有一定作用［9－11］。

表5 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞增殖的影响(±s，n=15)

表5 那如-3丸对佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞增殖的影响(±s，n=15)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

吸光度值正常对照组 － 12 0.091±0.059组别 剂量/(g/kg·d)样本数/只**模型组 － 12 0.240±0.070那如－3丸大剂量组 0.4 12 0.123±0.045*那如－3丸小剂量组 0.8 12 0.108±0.053*雷公藤片 0.52 12 0.115±0.026*

实验结果表明，AA组大鼠经弗氏完全佐剂刺激后，产生的 IL－l、TNF－a水平明显升高，阻抑由它们介导的关节炎症(降低PGE2和NO含量)，降低关节肿胀度(P＜0.05)，同时发现，经弗氏完全佐剂诱导的AA大鼠脾淋巴细胞增殖反应增强，而不同剂量的那如－3可以明显下调AA大鼠升高的脾淋巴细胞增殖反应。

综上所述，那如－3丸对AA大鼠具有明显的治疗作用，其作用机制可能与调节机体异常的免疫功能和维持细胞因子网络平衡有关。此结果为将那如－3丸开发为治疗人类RA的新药提供了初步的实验依据。

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