抗体膜片法检测乳腺癌患者血清C-erbB-2蛋白及其方法学评价①

于秀艳 曾常茜 刘晓峰 （吉林省肿瘤医院,长春 130012）

抗体膜片法检测乳腺癌患者血清C-erbB-2蛋白及其方法学评价①

于秀艳 曾常茜②刘晓峰 （吉林省肿瘤医院,长春 130012）

目的:建立血清C-erbB-2蛋白的抗体膜片检测方法,并进行方法学评价。方法:抗体膜片法检测血清C-erbB-2蛋白,免疫组化方法检测乳腺组织C-erbB-2蛋白。结果:30例乳腺癌、26例乳腺增生、30例正常对照组血清中C-erbB-2蛋白阳性率分别为40.0%、7.7%和6.7%,三组相比较有显著差异（P＜0.05）;乳腺癌组织C-erbB-2蛋白阳性和阴性者其血清C-erbB-2蛋白阳性率分别为91.67%和11.11%,血清与乳腺组织C-erbB-2蛋白表达具有相关性（P＜0.01）;抗体膜片法检测血清C-erbB-2蛋白的灵敏度、特异度和准确度分别为40.0%、92.8%和74.4%。结论:抗体膜片法检测血清C-erbB-2蛋白与乳腺癌病理学诊断符合率高,且方法简便易行,临床具有实用价值。

C-erbB-2蛋白;乳腺癌;乳腺增生;抗体膜片法

C-erbB-2蛋白是癌基因C-erbB-2编码的跨膜糖蛋白受体,分子量为185 kD,因此又称p185蛋白。C-erbB-2蛋白具有酪氨酸激酶活性,被异常激活后发生自身磷酸化,并磷酸化其他底物,引起下游的信号转导,最终导致细胞的增殖乃至癌变。自从文献报道C-erbB-2扩增和/或过度表达与乳腺癌发生、发展及预后的关系后,引起了人们对C-erbB-2及其表达产物研究的关注。伴随着C-erbB-2蛋白功能的发挥,受体的细胞外区域释放入血,血清C-erbB-2蛋白水平对于判断乳腺癌的发生、发展、预后及复发具有重要意义[1-4]。本实验采用抗体膜片检测血清C-erbB-2癌蛋白,旨在为乳腺癌的诊断提供特异、敏感、实用的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 乳腺癌患者术前血清及组织30例（经病理确诊）,由吉林省肿瘤医院提供,患者均为女性,年龄 24～75岁,其中浸润性导管癌17例,浸润性小叶癌10例,导管原位癌1例,小叶原位癌1例,乳头状癌1例。乳腺增生患者术前血清及组织26例（经病理确诊）,由北华大学医学院附属医院提供,患者均为女性,年龄23～50岁。正常血清30份,由北华大学医学院附属医院提供,均为女性,年龄25～46岁。

1.1.2 试剂 C-erbB-2蛋白单克隆抗体（A18、A21）均为中国科技大学生命学院刘兢教授惠赠;乳腺癌细胞珠MCF-7由吉林省肿瘤研究所提供;C-erbB-2蛋白阳性抗原为SKBR-3细胞裂解液,购自美国Neomarkers公司;NC膜为丹麦NUNC公司产品;辣根过氧化物酶标记链亲合素（SA-HRP）购自北京中山生物技术有限公司;超敏SP试剂盒、C-erbB-2单克隆抗体、DAB、C-erbB-2免疫组化阳性对照片、多聚-L-赖氨酸均购自福州迈新生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 C-erbB-2单克隆抗体A21的生物素标记（Bio-A21）及鉴定参照文献[5]方法进行。

1.2.2 抗体膜片法检测血清C-erbB-2蛋白 用C-erbB-2单克隆抗体（A18）溶液（20μg/m l）点样5μl,待膜干燥后,用PBST洗膜5次。加1%BSA溶液37℃封闭30分钟,用PBST洗膜5次。点加待测血清5μl,同时设C-erbB-2蛋白阳性和阴性对照,37℃孵育40分钟,PBST洗膜5次。点加生物素标记的C-erbB-2蛋白单克隆抗体（Bio-A21）（1∶500）5μl,37℃孵育30分钟,PBST洗膜5次。点加2μg/ml SA-HRP 5μl,37℃孵育30分钟,PBST洗膜5次。点加DAB溶液5μl,37℃反应15分钟,斑点出现后取出。用冰醋酸终止反应。

1.2.3 免疫组化方法检测组织C-erbB-2蛋白表达采用SA-生物素-HRP复合物法（SP法）。按照SP免疫组化试剂盒说明书操作,其中鼠抗人C-erbB-2单克隆抗体稀释度为1∶200,按美国食品和药品管理局（FDA）推荐的Herlep Test评分标准判定结果。

1.2.4 ELISA方法检测血清C-erbB-2蛋白 参考文献[5]的方法。

1.3 统计学分析 采用 χ2检验,以P＜0.01为差异有显著意义,以P＞0.05为差异无显著意义。

1.4 方法学评价 以病理诊断作为乳腺癌诊断的金标准,对血清C-erbB-2蛋白鉴别诊断乳腺癌作方法学评价,计算敏感度、特异度、准确度。

2 结果

2.1 抗体膜片法和ELISA法检测血清C-erbB-2蛋白结果 抗体膜片法检测血清C-erbB-2蛋白结果见图1,30例乳腺癌血清中,C-erbB-2蛋白12例阳性,18例阴性,阳性率为40.0%。26例乳腺增生血清中,C-erbB-2蛋白2例阳性,24例阴性,阳性率为7.7%。30例正常对照血清中,C-erbB-2蛋白2例阳性,28例阴性,阳性率为6.7%。经χ2检验,乳腺癌组血清C-erbB-2蛋白与乳腺增生、正常对照组相比较有显著差异（P＜0.05）。

上述血清标本同时用ELISA法检测血清C-erbB-2基因蛋白,结果30例乳腺癌血清中,C-erbB-2蛋白13例阳性,18例阴性,阳性率为43.3%。26例乳腺增生血清中,C-erbB-2蛋白3例阳性,23例阴性,阳性率为11.5%。30例正常对照血清中,C-erbB-2蛋白2例阳性,28例阴性,阳性率为6.7%。经 χ2检验,乳腺癌组血清C-erbB-2蛋白与乳腺增生、正常对照组相比较有显著差异（P＜0.05）。

抗体膜片法与ELISA法检测血清C-erbB-2基因蛋白的结果经统计学处理,二者无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 乳腺组织C-erbB-2蛋白表达结果 30例乳腺癌组织中,C-erbB-2蛋白12例阳性,18例阴性,阳性率为40%。26例乳腺增生组织未发现C-erbB-2蛋白的表达。经χ2检验,乳腺癌组织C-erbB-2蛋白的表达与乳腺增生组织相比较有显著差异（P＜0.05）。

2.3 血清C-erbB-2蛋白与乳腺组织C-erbB-2蛋白表达相关性结果 30例乳腺癌组织中,12例C-erbB-2蛋白阳性中有11例血清C-erbB-2蛋白升高,18例C-erbB-2蛋白阴性中有2例血清C-erbB-2蛋白升高。经 χ2检验,血清C-erbB-2蛋白与乳腺组织C-erbB-2蛋白表达比较P＜0.01,说明血清C-erbB-2蛋白与乳腺组织C-erbB-2蛋白表达存在相关性。

图1 血清C-erbB-2蛋白检测结果Fig.1 The results of seral C-erbB-2 protein

表1 血清C-erbB-2蛋白诊断乳腺癌的方法学评价Tab.1 Themethologicalevaluation for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients

2.4 方法学评价结果 以病理诊断作为乳腺癌诊断的金标准,对血清C-erbB-2蛋白鉴别诊断乳腺癌作方法学评价。30例乳腺癌患者中12例C-erbB-2蛋白升高,26例乳腺增生患者中2例C-erbB-2蛋白升高,30例正常对照中2例C-erbB-2蛋白升高（表1）。经计算,灵敏度=12/30×100%=40.0%,特异度=52/56×100%=92.8%,准确度=64/86×100%=74.4%。

3 讨论

乳腺增生与乳腺癌是临床上常见的乳腺疾病,目前临床最常用的鉴别方法是病理学诊断,不仅取材不便,还会给乳良增生患者造成不必要的损伤和痛苦。因此,寻找一种准确、敏感的生物学指标和检测方法具有重要意义。

Lanrent发现C-erbB-2基因蛋白分子的细胞部分可以从乳腺癌细胞脱落并分泌到血清中,利用C-erbB-2蛋白胞外部分的单克隆抗体建立了ELISA方法检测血清中C-erbB-2基因蛋白,也有学者用单克隆抗体6G10、SV-2-61、A18和A21等作为包被抗体和酶标抗体建立EIA检测C-erbB-2基因蛋白[5-7]。本实验建立了血清C-erbB-2蛋白的抗体膜片法,并对血清C-erbB-2蛋白与乳腺组织C-erbB-2蛋白表达的相关性进行分析,发现血清C-erbB-2蛋白与组织C-erbB-2蛋白表达水平存在相关性,与ELISA法无显著差异,说明该方法可靠性好。以病理诊断为金标准,该抗体膜片法检测血清C-erbB-2蛋白的灵敏度为40.0%,特异度为92.8%,准确度为 74.4%,说明该方法与临床病理学诊断方法符合率较高。此外,该抗体膜片法克服了免疫组化方法检测组织C-erbB-2蛋白的取材不便,与ELISA相比操作简便易行,结果易携带和保存,因此临床实用性较强。本研究还有待于增加检测例数,为尽早在临床上应用积累更多的资料。

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3 Leitzel K.Elavated serum c-erbB-2 antigen levelsand decreased response tohormone therapy of breast cancer[J].JClin Oncol,1995;13（5）:1129-1131.

4 Shigeru I,Hisanao O,KokichiS.Determination of cytosol c-erbB2 protein in breast cancer by sandwich Enzyme Immunoassay[J].Jpn JClin,1998;28（2）:92-94.

5 曾常茜,于秀艳,王振明.血清p185蛋白与p185糖链测定方法的比较[J].现代免疫学,2005;25（6）:484-487.

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7 Wu JT,AstillM E,Gagon SDetal.Measurement of c-erbB-2 proteins in sera from patientswith carcinomasand in breast tumortissue cytosols:correlation with serum tumormarkersandmembrane-bound oncoprotein[J].J Clin Lab Anal,1995;9（3）:151-165.

[收稿2010-03-08 修回2010-08-25]

（编辑 许四平）

Methological evaluation for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patientsw ith the assay of antibodymembrane technique

YUXiu-Yan,ZENGChang-Qian,LIUXiao-Feng.CancerHospitalofJilinProvince,Changchun130012,China

Objective:To establish and evaluate for seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients with antibody membrane technique.Methods:SeralC-erbB-2 protein was detected with antibodymembrane technique.The expression of C-erbB-2 protein in breast tissue was detectedwith immunohistochemical technique.Results:The positive rates of C-erbB-2 protein in sera of 30 breast cancer,26 breast proliferation patients and 30 normal controlswere40.0%,7.7%and 6.7%respectively.There was obvious difference in seral C-erbB-2 protein in breast cancer patients comparedwith those in breastproliferation patients and normal control（P＜0.05）.The positive rate of seral C-erbB-2 protein in C-erbB-2 positive breast tissue and C-erbB-2 negative tissuewere 91.67%and 11.11%respectively.There was a correlation between seral C-erbB-2 protein and expression of C-erbB-prote in breast tissue（P＜0.01）.The sensitivity,specificity and accuracy of seral C-erbB-2 protein breast cancerwere 40.0%,92.8%and 74.4%respectively.Conclusion:The antibodymembrane technique for seral C-erbB-2 protein accordswith pathologic diagnosis highly in dignosing breast cancer.In addition,themethod is easy and practical clinically.

C-erbB-2 protein;Breast cancer;Breastproliferation;Antibodymembrane technique

R446.61

A

1000-484X（2010）12-1130-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.017

①本文为长春市科技发展计划项目（No.03-205544）

②大连大学辽宁省生物有机重点实验室,大连116622

于秀艳（1968年-）,女,主任技师,主要从事肿瘤免疫学研究,E-mail:yuxiuyan1968@sohu.com;

及指导教师:曾常茜（1964年-）,女,教授,研究生导师,主要从事肿瘤免疫学研究,E-mail:zengchangqian@163.com。

·临床免疫学·