急性心肌梗死患者外周血内皮祖细胞早晚期集落数目和功能的变化＊

任国庆,汪奕斌,张浩,孙文文,严金川

急性心肌梗死患者外周血内皮祖细胞早晚期集落数目和功能的变化＊

任国庆,汪奕斌,张浩,孙文文,严金川＊

目的：探讨急性心肌梗死(AMI)患者外周血内皮祖细胞早晚期集落数目及功能的变化。

方法：我院心内科住院患者 74例,分成 3组：AMI组 28例、稳定性心绞痛组(心绞痛组)26例、非冠心病组(对照组)20例。密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(MNCs),EGM-2MV培养液培养扩增。第 7天和 21天后通过形态学、双荧光染色及细胞表面分子标志鉴定内皮祖细胞,分别计数早期、晚期内皮祖细胞集落数目,酶联免疫吸附法测定上清液中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)浓度。采用二苯基四氮唑嗅盐(MTT)比色法、改良的 Boyden小室和黏附能力测定观察内皮祖细胞的增殖、迁移和黏附能力。

结果：AMI组早期内皮祖细胞集落数目显著高于心绞痛组和对照组(P＜0.01),但SDF-1水平显著低于心绞痛组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01);心绞痛组早期内皮祖细胞集落数目和 SDF-1水平显著低于对照组(P＜0.05或 0.01)。AMI组晚期内皮祖细胞集落数目,增殖、迁移细胞和贴壁细胞显著低于心绞痛组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01),心绞痛组显著低于对照组(P＜0.01)。

结论：AMI患者急性期早期内皮祖细胞集落数目增加,但其分泌功能严重受损,晚期内皮祖细胞集落数目减少,增殖、迁移和黏附功能下降。

急性心肌梗死;内皮祖细胞;集落

(Chinese Circu lation Journal,2010,25：428.)

内皮祖细胞是一类尚未表达成熟血管内皮细胞表型但能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。研究表明急性心肌梗死(AMI)患者的内皮祖细胞在不同时期表达不同[1]。本文报告 AMI患者急性期外周循环血两种内皮祖细胞集落数目和功能的变化。

1 材料与方法

研究对象：2008-12至 2009-08我院心内科住院患者 74例,分成 3组：①AMI组：28例,均为首次发病的急性 ST段抬高型心肌梗死患者,入院距发病时间 ＜24 h,平均(12±8.7)h,心电图、心肌酶谱、肌钙蛋白的动态演变符合AMI诊断;急诊冠状动脉(冠脉)造影提示罪犯血管累及前降支 11例,左回旋支 8例,右冠 9例,血管多支病变 10例,单支病变 18例;心功能 Killip分级：Ⅳ级 3例,Ⅲ级 5例,Ⅱ级 6例,Ⅰ级 14例。②稳定性心绞痛组(心绞痛组)：26例,冠脉造影提示多支病变 9例,单支病变 17例;心功能分级：Ⅳ级 2例,Ⅲ级 5例,Ⅱ级 4例,Ⅰ级 15例。 ③非冠心病组(对照组)：20例,冠脉造影提示血管无病变,或狭窄程度﹤ 50%。有严重肝肾肺功能障碍、急(慢)性炎症或自身免疫性疾病、恶性肿瘤、6个月内外伤或手术史者排除。所有患者均在服药前采血,并记录其基本特征。

试剂与仪器：EGM-2MV培养液购于美国 Clonetics公司,标记物 PE-CD34、FITC-VEGF-2(KDR)、FITCCD133、FITC-CD14均购于美国 eBioscience公司,FACSCalibur流式细胞仪为美国 BD公司产品,人纤维连接蛋白(HFN)购于美国 Chemicon公司,基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的酶联免疫吸附试剂盒购自美国 R＆D systems公司。

单个核细胞分离和培养：所有对象均在入选 24 h内抽肘静脉血 20 ml,密度梯度离心法获得单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包埋的 24孔培养板,每隔2 h去除 1次未黏附细胞,共 2次,然后加入 EGM-2MV培养液放入培养箱培养(37℃、5%二氧化碳、湿度95%),4天后更换培养液,此后隔天更换 1次,细胞融合约 80%时进行传代。

内皮祖细胞鉴定和细胞集落计数：①形态与计数：培养第 7天和第 21天在 40倍倒置显微镜下直接观察培养板上形成的细胞集落形态,随机选 3个视野进行计数,求平均值;②双荧光染色法：将培养的细胞在含有Dil-ac-LDL的培养液中孵育 24 h,然后4%中性甲醛 4℃固定 10min,激光共聚焦显微镜下摄片。磷酸盐缓冲液漂洗后加 FITC-UEA-1(10 mg/L)1 h,激光共聚焦显微镜下摄片。不加 Dil-ac-LDL和 FITC-UEA-1的同批培养细胞作空白对照。阴性对照采用 GSC7901(胃癌细胞株);③细胞表面分子标志：0.25%胰酶消化,制成 1×106cells/m l的单个细胞悬液,加入荧光标记的白细胞分化抗原 CD34、VEGFR-2、CD133和 CD14及同型对照抗体,4℃避光孵育 30min,流式细胞仪分析细胞白细胞分化抗原 CD34、VEGFR-2、CD133和 CD14的表达。

SDF-1浓度测定：早期集落出现后用 Hanks洗涤细胞 3次,加无血清 DMEM培养基 37℃孵育 72 h。收集 24孔板各孔液体,离心(600 g,10min)以去除细胞碎片。酶联免疫吸附法测定上清液 SDF-1浓度。

黏附能力检测：晚期集落出现时用 0.25%胰蛋白酶消化搜集贴壁细胞,悬浮于 500μl培养液,计数,然后将同等数目的内皮祖细胞铺在包被有 HFN培养板,在 37℃培养 30 min,计数贴壁细胞。

迁移能力检测：如上搜集贴壁细胞并计数。将25μl培养液和血管内皮生长因子(50 ng/ml)加入改良的 Boyden小室的下室,将 2×104内皮祖细胞悬浮在 50μl培养液注入上室,培养 24 h,刮去滤膜上面的未移动细胞,用甲醇固定,Giemsa染色,随机选择 3个显微镜视野(×400)计数迁移到低层的细胞。

增殖能力检测：如上搜集贴壁细胞并计数。再将等量内皮祖细胞接种到包被有 HFN96孔培养板,每孔加 10μl MTT(5mg/m l),培养 4 h后,吸弃上清液,再加入二甲基亚砜(150μl/孔),于微量振荡器充分振荡10 min,置酶标仪于波长 490 nm处测 A值。

统计学方法：采用 SPSS13.0统计软件进行分析。计量数据以±s表示,多个均数间的比较采用单因素方差分析,然后进行两两比较的 LSD检验。计数资料用百分数表示(%),组间比较采用 χ2检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

临床特征：三组的年龄、性别、吸烟、高血压、高密度脂蛋白、体重指数差异均无统计学意义(P＞0.05)。AMI组与对照组比糖尿病、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、入院前他汀类和 ACEI用药均增高,左心室射血分数降低,差异均有统计学意义(P均 ＜0.05)。心绞痛组与对照组比甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、入院前他汀类和 ACEI用药均高,左心室射血分数降低,差异均有统计学意义(P均 ＜0.05)。AMI组与心绞痛组比左心室射血分数降低(P＜0.05),其余指标差异均无统计学意义(P均 ＞0.05),见表 1。

表 1 三组临床特征比较(±s)

表 1 三组临床特征比较(±s)

注：与心绞痛组比较 ＊P＜0.05;与对照组比较 △P＜0.05 ACEI：血管紧张素转换酶抑制剂 AMI：急性心肌梗死

临床资料 对照组(n=20)心绞痛组(n=26)AM I组(n=28)年龄(岁) 58.0±7.8 60.5±8.7 62.4±8.9男[%(例)] 70.00(14) 69.23(18) 71.43(20)吸烟[%(例)] 50.00(10) 53.85(14) 57.14(16)高血压[%(例)] 40.00(8) 38.46(10) 42.86(12)糖尿病[%(例)] 15.00(3) 19.23(5) 28.57(8)△甘油三酯(mmol/L) 1.36±0.34 1.87±0.57△ 2.16±0.70△总胆固醇(mmol/L) 3.51±0.53 4.90±0.94△ 5.35±1.10△低密度脂蛋白(mmol/L) 1.84±0.75 2.77±0.93△ 3.24±1.21△高密度脂蛋白(mmol/L) 0.84±0.18 0.78±0.16 0.77±0.15体重指数(kg/m2) 23.6±4.3 26.3±3.5 25.8±3.2左心室射血分数 0.70±0.07 0.54±0.06△ 0.42±0.04△＊入院前他汀类用药[%(例)]0(0)26.93(7)△21.43(6)△入院前 ACEI用药[%(例)]20.00(4)34.62(9)△39.29(11)△

内皮祖细胞鉴定：①形态：7天后可见簇状聚集的早期集落,中间是圆形细胞,周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞(图 1a)。21天后可观察到晚期集落,细胞紧密贴壁,聚集向外生长,呈多角形或纺锤形(图 1b)。晚期集落可以传代,呈现内皮细胞典型的铺路石样外观;②荧光显微镜法：早晚期内皮祖细胞集落在激光共聚焦显微镜下 DiI-Ac-LDL、FITC-UEA-1呈双染色阳性(图 2a,2b,2c);③流式细胞技术：早期集落主要表达标记物 CD34、VEGFR-2、CD133和 CD14,晚期集落表达更高水平的标记物 CD34和 VEGFR-2,仅有微量表达标记物 CD133和 CD14。

图 1 内皮祖细胞形态 图1a 早期集落(×200) 图 1b 晚期集落(×200) 图 2 荧光显微镜下内皮祖细胞图 2a 吸附 Dil-ac-LDL呈红色(×200) 图 2b 吸附 FITC-UEA-1呈绿色(×200) 图 2c 双阳性细胞呈黄色(×200)

各组早晚期内皮祖细胞集落数目及功能比较：AMI组早期内皮祖细胞集落数目显著高于心绞痛组和对照组(P＜0.01),但 AMI组细胞培养上清液中SDF-1水平、晚期内皮祖细胞集落数目、增值、迁移细胞和贴壁细胞均显著低于心绞痛组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01)。心绞痛组的上述指标均显著低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05或 0.01)。见表 2。

表 2 各组早晚期内皮祖细胞集落数目及功能比较(±s)

表 2 各组早晚期内皮祖细胞集落数目及功能比较(±s)

注：与心绞痛组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01;与对照组比较 △P＜0.05△△P＜0.01 SDF-1：基质细胞衍生因子-1。余注见表1

对照组(n=20)心绞痛组(n=26)AMI组(n=28)早期内皮祖细胞集落数目4.1±1.6 3.0±1.1△6.7±2.1＊＊△△SDF-1(pg/m l) 142.75±29.91 119.38±24.03△△ 103.07±15.12＊△△晚期内皮祖细胞集落数目3.9±1.8 2.6±1.5△△1.6±1.2＊△△增值(A490nm) 0.477±0.085 0.340±0.057△△ 0.294±0.051＊△△迁移细胞 /400细胞 14.5±3.3 10.4±2.2△△ 8.9±1.9＊△△贴壁细胞 /200细胞 31.0±6.7 23.4±5.1△△ 19.7±4.9＊△△

表3 急性心肌梗死组冠脉病变部位及心功能与早晚期内皮祖细胞的关系(±s)

表3 急性心肌梗死组冠脉病变部位及心功能与早晚期内皮祖细胞的关系(±s)

注：注解见表 2

病变部位/心功能 例数 早期内皮祖细胞集落数目SDF-1水平(pg/m l)晚期内皮祖细胞集落数目前降支闭塞 11 6.4±1.8 98.13±14.34 1.4±1.1左回旋闭塞 8 6.7±2.2 105.25±16.70 1.7±1.3右冠闭塞 9 6.9±2.3 101.23±15.89 1.8±1.3多支病变 10 6.5±2.0 97.34±14.78 1.5±1.2单支病变 18 6.9±2.4 106.45±17.54 1.7±1.3心功能 KillipⅣ级 3 7.0±2.3 105.36±16.56 1.8±1.1心功能 KillipⅢ级 5 6.6±1.8 101.78±15.21 1.4±1.2心功能 KillipⅡ级 6 6.8±1.9 106.29±16.42 1.7±1.3心功能 KillipⅠ级 14 6.5±2.0 101.96±14.58 1.7±1.4

AMI组冠脉病变部位及心功能与早晚期内皮祖细胞关系：AMI组不同冠脉病变部位及不同心功能患者的早期内皮祖细胞集落数目、SDF-1水平和晚期内皮祖细胞集落数目有差异,但无统计学意义 (P＞0.05)。见表 3。

3 讨论

文献报道内皮祖细胞在培养时可以出现两种集落,早期内皮祖细胞集落来源于 CD14+的单核 /巨噬细胞[2],在第 7～14天出现,中间细胞呈圆形,周边有向外爬行生长的梭状或多角形细胞,细胞主要表达 CD 34、VEGFR-2、CD133和 CD14,激光共聚焦显微镜下 DiI-Ac-LDL、FITC-UEA-1呈双染色阳性。第21天后出现的属于晚期内皮祖细胞集落,来源CD34+的造血干细胞[3],细胞紧密贴壁聚集向外生长,呈多角形或纺锤形,可以传代,呈现内皮细胞典型的铺路石样外观,激光共聚焦显微镜下 DiI-Ac-LDL、FITC-UEA-1呈双染色阳性,细胞表达更高水平的 CD34和 VEGFR-2,仅有微量表达 CD133和CD14,本结果与之相符。

许多因素可以增加骨髓中内皮祖细胞向外周血动员,如内源性动员剂金属蛋白酶-9、血管生长因子、SDF-1、粒细胞集落刺激因子、血小板衍生生长因子-CC、促红细胞生成素、干细胞因子等,外源性有 HMGCoA还原酶抑制剂、血管转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂等。本研究发现 AMI组患者早期内皮祖细胞集落数目增加,表明冠脉急性缺血缺氧可能是动员骨髓内皮祖细胞向外周释放的有效因素,其机制与缺血缺氧可以促进血管生长因子、SDF-1、单核细胞趋化蛋白[4]等内源性趋动因子表达、增加骨髓内皮祖细胞的动员有关。

Hill[5]等报道内皮祖细胞数量与冠心病 Framingham危险因素积分成反向线性关系,而且高危者内皮祖细胞更易老化。本研究中 AMI组和心绞痛组患者甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、糖尿病高于对照组患者,而早期集落的分泌功能和晚期集落的数量、迁移、增殖、粘附能力却较对照组下降,支持危险因素对内皮祖细胞有影响的观点。

研究发现早期集落增殖能力弱,2～3周后达高峰,之后开始逐渐凋亡,不能传代,体外培养不能产生血管结构,晚期集落增殖能力旺盛,可连续传代培养12周而未见凋亡,体外培养能产生血管结构[6]。Hur等[1]也报道,早期集落和晚期集落混合培养时,前者通过分泌生长因子促进晚期集落增殖并形成内皮细胞,提示早晚期内皮祖细胞在血管修复和新血管形成的过程中所起作用可能不同,虽然早期内皮祖细胞不能分化为成熟的内皮细胞,不能直接进行细胞替代修复血管或形成新血管,但通过分泌血管生长因子、白介素-8、SDF-1、凝血酶原激酶[7]等,可以增加血管渗透性和趋化梯度,促进晚期内皮祖细胞的粘附和迁移,降解基质形成毛细血管样管道,因此早期内皮祖细胞的分泌功能对损伤内皮的修复有重要作用。本研究中尽管 AMI患者内皮祖细胞的早期集落数量增加,但同心绞痛患者一样,AMI患者早期集落的分泌功能下降,促进晚期集落增殖的能力下降,最终对修复血管和促进新生血管形成产生不利影响。这就提示我们只对早期内皮祖细胞进行计数是不够的,应该更加全面了解内皮祖细胞各亚群的数量和功能变化。

冠脉病变的部位和心功能状态与早晚期内皮祖细胞的数量和功能可能无关,本研究未发现 AMI患者不同罪犯血管、血管病变支数、心功能状态对早晚期内皮祖细胞的数量和早期内皮祖细胞分泌功能有影响,宜增加样本数量进一步研究。

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(编辑：王宝茹)

Changes of Peripheral Endothelial Progenitor Cells at the Early and Late Stages in PatientsWith Acute Myocardial Infarction

REN Guo-qing,WANG Yi-bin,ZHANG Hao,SUNWen-wen,YAN Jin-chuan.
Department of Emergency,Affiliated Hospital of Jiangsu University,Zhen jiang(212001),Jiangsu,China Corresponding Author：REN Guo-qing,Email：doctorgq@sohu.com

Objective：To explore the amount and functional changes of peripheral endothelial p rogenitor cells(EPCs)at the early and late stages in patients with acutemyocardial in farction(AMI).

Methods：A totalof 74 in-hospital patientswere divided into three groups,AMIgroup,n=28,stable angina pectoris(SA)group,n=26,and Control group,n=20,in which the patientswithout coronary heart disease.Mononuclear cellswere isolated and cu ltured in EGM-2MV medium.EPCs were identified bymorphology and doub le fluorescence staining.The cell colonies at the early and late stageswere counted 7days and 21days after the cu lture.The level of stromal cell-derived factor-1(SDF-1)in conditioned medium was detected by ELISA,EPC proliferation and migration were examined by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay and modified Boyden chamber assay respectively.

Resu lts：The amountof early EPC colonieswas significantly higher in AMIgroup than that in SA group and in Control group(P＜0.01 respectively),but the secreted SDF-1was obviously lower in AMIgroup than that in SA group and Control group(P＜0.05 and P＜0.01).The early colony number and SDF-1 level were obviously lower in SA group than that in Control group(P＜0.05 and P＜0.01).The amountand function of cell p roliferation,migration and adhesion of late EPC colonies were significantly lower in AMIgroup than that in SA group and Control group(P＜0.05and P＜0.01),and these indexwere also lower in SA group than that in Controlgroup(P＜0.01).

Conclusion：The amountof EPC colony has been significantly increased at theearly stageof AMI,but the cell secreting function damaged severely.The EPC colony has been decreased at the late stage of AMIwith the impaired cell proliferation,migration and adhesive function.

Acutem yocardial infarction;Endothelial progenitor cells;Colony

江苏大学 2008年度临床医学科技发展基金资助项目(JLY 20080035)

212001 江苏省镇江市,江苏大学附属医院 急诊科(任国庆、张浩);江苏大学临床医学院(汪奕斌、孙文文);江苏大学附属医院心内科(严金川)

任国庆 主任医师 硕士 科主任 主要研究方向为冠心病的基础与临床 Email：doctorgq@sohu.com 通讯作者：任国庆

R54

A

1000-3614(2010)06-0428-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2010.06.008

2010-04-06)

◦冠心病研究◦