乳酸对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤后适应的心肌保护作用＊

张国明,王禹,李天德,张大为,刘秀华,李玉珍

乳酸对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤后适应的心肌保护作用＊

张国明,王禹,李天德,张大为,刘秀华,李玉珍＊

目的：在大鼠急性心肌缺血再灌注中,探讨乳酸延长局部组织酸中毒能否模拟后适应发挥有效的心肌保护作用。

方法：72只 SD大鼠随机分为假手术组、再灌注损伤组、后适应组和乳酸组,每组 18只。测定再灌注 10min后右心房血浆pH值,并在不同时间点处死大鼠,分别测定心肌酶活力、心肌丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、心肌组织线粒体吸光度,磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶、线粒体调控因子Bcl-2和 Bax的表达,以及细胞凋亡和心肌梗死面积。

结果：再灌注 10min后乳酸组与后适应组右心房血浆pH值相似(P＞0.05)。再灌注 1h后乳酸组和后适应组同再灌注损伤组相比均显著抑制了线粒体吸光度的降低(P＜0.05),但再灌注 6 h后乳酸组抑制作用明显减弱(P＞0.05)。乳酸组和再灌注损伤组相比未改变心肌组织丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性(P＞0.05)。磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶、Bcl-2和Bax的表达上乳酸组虽优于再灌注损伤组(P＜0.05),但同后适应组相比差异仍有统计学意义(P＜0.05)。另乳酸组可不同程度降低心肌酶活力、凋亡指数和心肌梗死面积,但凋亡指数仍显著高于后适应组(P＜0.05)。

结论：乳酸可以部分模拟后适应带来的保护效应,局部酸中毒的短暂延长可能只是后适应最上游触发因子之一。关键词 后适应;再灌注损伤;乳酸;酸中毒;线粒体通透性转换孔

(Chinese Circulation Journal,2010,25：34.)

迅速有效再灌注治疗是应对急性心肌缺血的最佳方法,但可带来再灌注损伤。2003年 Zhao等[1]提出了缺血后适应的概念,多项研究证实后适应可有效减轻再灌注损伤[2-4],研究认为后适应的保护机制最后都归于线粒体通透性转换孔的抑制[5,6]。Cohen等[7]提出了后适应触发因子的酸中毒假说,认为碳酸缓冲液可模拟后适应的保护作用。本研究在活体大鼠心肌梗死再灌注模型中,使用乳酸延长局部组织酸中毒模拟后适应,以进一步探讨后适应保护机制的上游触发因子。

1 材料与方法

材料：健康雄性 SPF级 SD大鼠 72只,于 2008-07至 2008-11购于军事医学科学院实验动物中心,体重200～250 g。乳酸购自北京化学试剂公司,微量丙二醛和超氧化物歧化酶试剂盒购自南京建成科技有限公司,心肌组织线粒体提取试剂盒和通透性转换孔比色法检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。兔抗小鼠磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶、线粒体调控因子Bcl-2和 Bax多克隆抗体购自美国 SantaCruz公司,凋亡试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

模型制作：按赵秀梅等[8]的球囊垫扎法复制大鼠在体心肌梗死再灌注模型。以 2%戊巴比妥钠(0.23ml/100 g)腹腔注射麻醉,呼吸机辅助呼吸,开胸后在左心耳下缘与肺动脉圆锥间用缝合线穿过前降支深部,将充盈的后扩张球囊[Acrostak公司,瑞士,压力调为 1大气压(ATM)]垫于血管与结扎线之间,结扎后将压力调节为 12 ATM。缺血 45分钟后将压力迅速调为 0 ATM,根据分组给予不同处理。术后 24小时(每组 6只),以20%乌拉坦(0.8ml/100 g)腹腔注射麻醉,经右颈总动脉插管入左心室,监测主动脉及左心室压力,而后经颈动脉插管取血 3～4m l,处死取心脏(另术后 1小时和术后 6小时每组各取6只大鼠,麻醉后直接处死取心脏)。

实验分组：随机分为 4组(每组 18只)：假手术组：分离左冠状动脉并穿线,但不结扎,旷置 45min后微量注射器(100μl)注射生理盐水 60μl;再灌注损伤组：缺血 45min后将压力调至 0 ATM,移除球囊后立即微量注射器在缺血部位分三点注射生理盐水共计60μl,而后持续再灌注;后适应组：缺血 45 min后、再灌注前通过球囊放气—充盈实现再灌注和缺血反复 4轮,其时间为 20/20 s×4,移除球囊后立即微量注射器在缺血部位分三点注射生理盐水共计 60μl,而后持续再灌注;乳酸组：缺血 45min移除球囊后,立即使用微量注射器在缺血部位分三点注射乳酸共计 60μl,而后持续再灌注。

缺血心肌丙二醛和超氧化物歧化酶活性测定：使用术后 1 h处死大鼠,检测方法按试剂盒说明书进行。缺血心肌线粒体通透性转换孔测定：使用术后 1 h和6 h处死大鼠,取出心脏后迅速冷冻,2周内进行检测。首先差速离心法提取线粒体(低温离心机 1000 g 10分钟,取上清低温高速离心机 10000 g 15分钟,沉淀物为线粒体),詹纳斯绿 B对线粒体进行鉴定;蛋白定量后取线粒体(每组含蛋白 200μg)按试剂盒说明书稀释、诱导,使用酶标仪在 520 nm测定线粒体吸光度,取0min、1min、5min、15min、30 min五个时间点检测。蛋白免疫印迹分析：使用术后 6 h处死大鼠,取出心脏迅速冷冻,2月内进行检测,匀浆后行聚丙烯酰胺凝胶电泳,经转膜、两次免疫反应,抗原抗体复合物用化学发光法显示,以 Image-Pro Plus图像分析软件分析蛋白条带的积分光密度值(平均光密度值 ×面积)。心肌酶活力测定：经动脉插管抽取动脉血后,3000 rpm离心 15min后取上清,冷冻保存,而后以全自动生化分析仪(日本日立公司)测定肌酸激酶和肌酸激酶同工酶活性。凋亡检测：使用术后 24 h处死大鼠,取心脏中性甲醛固定 24 h(10%,pH=7.4),按试剂盒说明行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。每张切片随机取5个高倍视野,计算出平均每 100个细胞中的凋亡细胞数,以百分数表示凋亡指数。心肌梗死面积测定：再灌注 24 h经颈动脉取血后,将颈动脉插管回抽至主动脉,开胸将原结扎丝线再次结扎,经颈动脉插管缓慢注入 1%伊文氏蓝 3～5m l。染色冷冻后按垂直于左心室长轴方向切片,置入 2%三苯基氯化四氮唑孵育20 min。扫描后采用 Image-Pro Plus图像分析软件分别计算各部分的面积。缺血心肌用缺血心肌面积与左心室面积之比表示,梗死范围以梗死心肌面积与缺血心肌面积之比表示。

2 结果

血流动力学：再灌注 24 h后 3组间心率和平均动脉压未见明显差异,后适应组和乳酸组与再灌注损伤组比较压力最大上升速度和压力最大下降速度明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);乳酸组与后适应组相比压力最大上升速度显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。 (表 1)

表 1 3组再灌注 24 h后的血流动力学比较(n=6,±s)

表 1 3组再灌注 24 h后的血流动力学比较(n=6,±s)

注：与再灌注损伤组比＊P＜0.05;与后适应组比△P＜0.05;1mmHg=0.133 kPa。

组别 心率(次/分) 平均动脉压(mmHg)压力最大上升速度(mmHg/s)压力最大下降速度(mmHg/s)再灌注损伤组 351.00±36.18 98.17±10.23 604.83±60.72 441.00±37.79后适应组 376.50±45.33 105.33±5.39 781.67±59.72＊ 546.67±57.79＊乳酸组 357.33±33.67 99.83±5.31 686.67±61.09＊△ 522.17±44.41＊

右心房血浆 pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比较：再灌注 10 min后右心房血浆 pH值、肌酸激酶及肌酸激酮同工酶乳酸组和后适应组之间没有明显差异,但这两组均较再灌注损伤组降低,差异有统计学意义(P＜0.05)。丙二醛含量后适应组低于再灌注损伤组,超氧化物歧化酶活性后适应组高于再灌注损伤组,差异有统计学意义(P＜0.05);而乳酸组这两项指标虽较再灌注损伤组好转,但差异无统计学意义(P＞0.05),乳酸组同后适应组之间这两项指标差异均有统计学意义(P＜0.05)。(表 2)

表 2 3组再灌注 10m in后右心房血浆pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比较(±s)

表 2 3组再灌注 10m in后右心房血浆pH值、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性及心肌酶比较(±s)

注：与再灌注损伤组比＊P＜0.05;与后适应组比△P＜0.05

组别 右心房血浆 pH值(n=18)丙二醛含量(nmol/mgpro,n=6)超氧化物歧化酶活性(U/mgpro,n=6)肌酸激酶(U/L,n=6)肌酸激酶同工酶(U/L,n=6)再灌注损伤组 7.43±0.03 1.54±0.28 35.48±12.48 1249.50±211.51 966.84±263.80后适应组 7.33±0.03＊ 1.12±0.37＊ 58.58±13.28＊ 582.50±263.15＊ 486.13±150.91＊乳酸组 7.32±0.07＊ 1.50±0.27△ 44.95±18.01△ 882.00±254.72＊ 690.03±329.64＊

缺血心肌组织线粒体吸光度：再灌注 1 h后连续30min乳酸组和后适应组线粒体吸光度无明显差异(P＞0.05);但两组均高于再灌注损伤组,差异有统计学意义(P＜0.05)。再灌注 6 h后连续 30min,乳酸组和后适应组线粒体吸光度均高于再灌注损伤组(乳酸组 15min和 30 min除外),差异有统计学意义(P＜0.05);乳酸组线粒体吸光度再灌注 6 h后连续 30min均显著低于后适应组(P＜0.05)。(表 3、4)

表 3 3组再灌注 1 h后线粒体吸光度比较(n=6,±s)

表 3 3组再灌注 1 h后线粒体吸光度比较(n=6,±s)

注：与再灌注损伤组比＊P＜0.05

组别 0min 1m in 5m in 15min 30m in再灌注损伤组 0.306±0.005 0.304±0.010 0.302±0.010 0.298±0.027 0.293±0.015后适应组 0.355±0.006＊ 0.360±0.011＊ 0.358±0.013＊ 0.353±0.023＊ 0.348±0.026＊乳酸组 0.351±0.006＊ 0.350±0.008＊ 0.348±0.010＊ 0.342±0.020＊ 0.338±0.020＊

表 4 3组再灌注 6 h后线粒体吸光度比较(n=6,±s)

表 4 3组再灌注 6 h后线粒体吸光度比较(n=6,±s)

注：与再灌注损伤组比＊P＜0.05;与后适应组比△P＜0.05

组别 0min 1m in 5m in 15 min 30m in再灌注损伤组 0.316±0.005 0.314±0.012 0.312±0.018 0.308±0.022 0.303±0.017后适应组 0.375±0.005＊ 0.372±0.016＊ 0.369±0.016＊ 0.363±0.028＊ 0.359±0.021＊乳酸组 0.341±0.006＊△ 0.338±0.006＊△ 0.334±0.018＊△ 0.329±0.020△ 0.320±0.017△

蛋白免疫印迹检测磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶、Bcl-2和 Bax的表达(表 5)：乳酸组和后适应组磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶和 Bcl-2表达较再灌注损伤组明显升高(P＜0.01),乳酸组显著低于后适应组 (P＜0.05)。Bax呈现相反变化,乳酸组和后适应组较再灌注损伤组明显降低,乳酸组显著高于后适应组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表 5 3组蛋白免疫印迹结果比较(n=6,±s)

表 5 3组蛋白免疫印迹结果比较(n=6,±s)

注：与再灌注损伤组比＊P＜0.05;与后适应组比△P＜0.05

组别 磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶 Bcl-2 Bax再灌注损伤组 0.28±0.05 0.02±0.01 2.40±0.45后适应组 2.77±0.79＊ 1.21±0.35＊ 0.37±0.11＊乳酸组 1.50±0.23＊△ 0.22±0.03＊△ 1.01±0.16＊△

心肌细胞凋亡：假手术组很少见到染色阳性的凋亡细胞。再灌注损伤组凋亡细胞明显多于乳酸组(15.00±1.90 vs 12.83±2.48,P＜0.05)和后适应组(15.00±1.90 vs 9.83±2.04,P＜0.05);乳酸组凋亡指数(12.83±2.48)%显著高于后适应组 (9.83±2.04)%,差异均有统计学意义(P＜0.05)。

心肌梗死面积：后适应组心肌梗死面积(27.97±10.89)%较再灌注损伤组(45.66±10.81)%降低,差异有统计学意义(P＜0.05);乳酸组(38.84±7.50)%低于再灌注损伤组,高于后适应组,但差异均未达统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

自 2003年 Zhao等提出缺血后适应的概念后,多种属研究均证实后适应可有效减轻再灌注损伤,但其保护机制的研究目前多集中在胞内信号的传导上,对最上游的触发因子研究较少。新近 Cohen等[7,9]提出了后适应的酸中毒假说,认为后适应的保护作用缘于短暂缺血延长了局部组织的酸中毒,从而抑制了线粒体通透性转换孔的开放。继而多项研究发现使用酸性灌注液[10-11]可以通过延长酸中毒发挥类似后适应的保护作用。因为缺血所致组织酸中毒为代谢性酸中毒,主要成分是乳酸,后适应短暂延长酸中毒即来自于乳酸冲散速度的减慢,所以使用乳酸模拟后适应延长酸中毒理论上更接近真实的生理变化过程。本研究在缺血心肌局部注射乳酸,可有效模拟局部组织的酸中毒,术后 10min右心房血浆 pH值结果显示乳酸组同后适应组相似,说明本实验方法较为成功的模拟了后适应延长的局部组织酸中毒。

目前认为线粒体通透性转换孔开放会引发线粒体肿胀,继而膜间隙前凋亡因子释放至胞浆导致细胞凋亡。本实验显示乳酸组在再灌注 1 h内可以发挥较好的抑制作用,但再灌注 6 h后抑制作用较后适应组明显减弱,到第 15min和 30min时乳酸组的保护效应几乎消失。细胞外信号调节蛋白激酶是后适应的重要保护途径;Bcl-2和 Bax是重要的线粒体调控因子,前者可抑制通透性转换孔的开放,而后者作用与其相反。本研究发现乳酸组磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶、Bcl-2/Bax较再灌注损伤组明显升高,但显著低于后适应组。这说明在此条途径的激活上乳酸只是部分模拟了后适应,这与上述通透性转换孔的变化相一致。

酸中毒假说认为后适应的保护效应缘于线粒体通透性转换孔的两次抑制,第二次抑制需要氧自由基作为中间分子才能正常传导。本研究结果也支持上述推论,乳酸组能抑制早期的通透性转换孔开放,但未能抑制后期转换孔开放。这可能缘于乳酸未显著降低氧自由基的生成(丙二醛和超氧化物歧化酶可以部分反映氧自由基的含量),而后者既起到了信号传导的作用,又因浓度过高损伤了心肌组织,故保护效果未能完全模拟。

综上所述,本研究发现局部注射乳酸能较好模拟后适应带来的酸中毒延长,可部分模拟其保护效果。但要完全探明后适应的最上游触发因子,还需要进一步的深入研究。

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(编辑：王宝茹)

Cardio-Protection of Lactate on Post-Conditioning of Acute Myocardial Ischemia Reper fusion in Rats

ZHANG Guo-ming,WANG Yu,LI Tian-de,ZHANG Da-wei,LIU Xiu-hua,LIYu-zhen.
Department of cardiology,Chinese PLA General Hospital,Beijing(100853),China Corresponding Author：WANG Yu,Email：wangyuheart@yahoo.com.cn

Objective：To test the hypotheses of lactate mimicking cardio-protection of post-conditioning by prolonging local acidosis of acutemyocardial ischemia reperfusion in rats.

Methods：Seventy two ratswere randomized into 4 groups：Sham operation group,Reperfusion/in jury(R/Igroup),Post-conditioning(Postgroup),the animatswere treated with 4 cycles of 20/20 s of reperfusion/re-occlusion,and Lactate group,the animatswere treated withmicro-injection of lactate at ischemicmyocardium.There were 18 rats in each group.Blood was taken from right atrium 10minutes after reperfusion tomeasure pH.All rats wereexecuted atdifferent time points to examine the contents of malonic dialdehyde(MDA),superoride dismutase(SOD),and the absorption ofm itochondria inmyocardium.Western blotanalysis was used to analyze the expression of phosphorylated ERK 1/2(P-ERK),Bcl-2 and Bax.Myocardial apoptosis and infarct size were also determined.

Resu lts：Blood pH was sim ilar in Lactate group and Postgroup(P＞0.05)10minutes after the reperfusion.Compared with R/Igroup,themyocardial absorp tion in Lactate group and Post group were both decreased 1h after the reperfusion(P＜0.05),and this phenomenon was attenuated 6h after reperfusion(P＞0.05).The levels ofMDA and SOD inmyocardium were sim ilar in Lactate group and R/Igroup(P＞0.05).The expressions of P-ERK,Bcl-2and Bax in Lactategroup were higher than that in R/Igroup(P＜0.05),but lower than that in Post group(P＜0.05).Myocardial enzyme activity,apoptotic index and infarct size in Lactate group were decreased at different degree,butapop totic index was still higher than that in Post group(P＜0.05).

Conclusion：Lactate could partlym im ic the cardio-protection of post-conditioning,and briefprolonged local acidosis in ischemicmyocardium m ight be one of trigger factors in the complex mechanism of post-conditioning.

Post-conditioning;Reperfusion injury;Lactate;Acidosis;mitochond rail Permeability transition pore

国家自然科学基金(No.30740080)

100853 北京市,中国人民解放军总医院 心血管内科 (张国明、王禹、李天德、张大为),病理生理学研究室 (刘秀华、李玉珍)

张国明 主治医师 博士 主要从事冠心病的基础和临床研究 Email：guomingheart@126.com通讯作者 ：王禹 Email：wangyuheart@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614(2010)01-0034-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2010.01.011

2009-07-08)

◦临床研究◦