肺炎链球菌HMGS基因克隆及同源模建
2010-02-02贲亚琍崔古贞张青叶刘德立
贲亚琍,崔古贞,张青叶,刘德立*
(1江汉大学,武汉 430016;2华中师范大学生命科学学院; 3华中师范大学化学学院)
甲羟戊酸途径是肺炎链球菌发育增殖必需的代谢途径,甲羟戊酸的代谢过程是一种潜在的新型抗生素药物作用靶标。目前,用计算机分析三维结构,用同源模建的方法寻找结构类似物来研究新药的开发是一个新的领域,有非常高的实用价值。2006年6月 ~2008年 6月,本研究选择肺炎链球菌的HMG-CoA合成酶 (HMGS)作为甲羟戊酸途径的靶酶,以粪肠球菌 HMGS的晶体结构为模板,通过SYBYL7.0软件,构建肺炎链球菌 HMGS的同源模建。
1 材料与方法
1.1 材料 肺炎链球菌购自武汉大学基础医学院。pET-28a由本室保存。氨苄青霉素、卡那霉素均购于武汉市亦新生物技术有限责任公司。DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、溶菌酶、TaqDNA聚合酶均购自 TaKaRa生物有限公司。S W ISS-MODEL sever,SYBYL Molecular Modeling Software,PROCHECK软件。其余均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 肺炎链球菌 HMGS基因 PCR 根据 Genbank中肺炎链球菌 HMGS基因序列 (No. AF290098)设计引物,正向引物和反向引物分别包含 EcoRⅠ和 NotⅠ酶切位点。PCR反应总体积为50μl,包括 10×Buffer 5μl(含 Mg2+),10 mmol/L dNTP 2μl,10μmol/L正向、反向引物各 2μl,Taq DNA聚合酶 1μl,模板DNA 1μl,水37μl。PCR反应程序:95℃加热预变性 5 min后,95℃变性 30 s, 50℃退火 30 s,72℃延伸 1 min,30个循环,最后 72℃延伸 10 min,4℃保温。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。采用DNA限制性内切酶酶切载体和样品,低熔点琼脂糖法回收DNA。DNA片段的回收采用DNA凝胶回收试剂盒。回收的载体与外源DNA片段按摩尔比 1∶10,并加入 1~3 U T4 DNA连接酶和 10×连接缓冲液,16℃连接过夜。重组质粒经适当限制性内切酶消化,电泳分析确证并鉴别外源片段及插入方向,或采用 PCR鉴定阳性重组子, DNA测序进一步鉴定。
1.2.2 同源模建 将 PCR获得肺炎链球菌 HMGS序列输入到 S W ISS-MODEL sever网站自动建模。经初步序列同源模板搜索,选出了以下几种原核生物同源性大于 30%的已知晶体结构的蛋白作为模板分子,HMGS模板分子晶体结构 PDB代号分别为: 1X9E[1],1HDB[2],1YSL[1],1XPK[3],1TVZ[4],它们与目标序列之间同源性在 47%~53%。按照已知晶体结构的粪肠球菌 HMGS序列[1]与 SP-HMGS之间的叠合方式模建 SP-HMGS空间三维结构。由S W ISS模建出的肺炎链球菌的 HMGS的初始空间三维结构 SYBYL软件进行加氢之后,再用 Powell方法和 Tripos力场 (SYBYL Molecular Modeling Software)进行分子力学简单优化,能量优化的收敛标准为变化梯度小于 0.05 kcal/mol。
2 结果
2.1 肺炎链球菌基因 HMGS基因克隆及序列鉴定以肺炎链球菌总DNA为模板,采用 PCR方法扩增肺炎链球菌 HMGS基因 (SP-HMGS gene),以EcoRⅠ/NotⅠ分别酶切肺炎链球菌HMGS基因PCR扩增产物和 pET28a载体并回收,将回收的HMGS基因亚克隆至载体 pET28a的 EcoRⅠ/NotⅠ位点,构建了重组子pET-HMGS,对HMGS基因进行测序,结果如下。
2.2 肺炎链球菌 HMGS同源模建 将模建出的目标蛋白质进行简单的动力学优化后与模板蛋白分子进行空间叠合。正如预料的一样,模建的目标蛋白质的空间三维结构整体走向与模板分子非常相似。
3 讨论
随着抗生素药物的广泛使用,肺炎链球菌耐药性问题日渐突出。近年资料显示抗青霉素肺炎链球菌(PRSP)、耐红霉素肺炎链球菌 (MRSP)及多重耐药菌株在全球持续增加,给临床治疗带来了困难。因此,开发新的抗生素药物非常迫切。目前,利用已有的生物大分子靶标的知识,以计算机为工具,通过理论模拟来指导和辅助新型药物分子的设计,可以避免研发药物的盲目性和缩短药物开发的周期。本研究以HMGS作为肺炎链球菌甲羟戊酸途径的靶酶,采用基因工程技术克隆了肺炎链球菌 HMGS基因,经测序获得肺炎链球菌 HMGS基因序列,其与已知晶体结构的粪肠球菌 HMGS(I X9E)的基因有53%同源序列,以粪肠球菌 HMGS的晶体结构为模板,通过 SYBYL7.0软件成功地构建了肺炎链球菌HMGS同源模建。用同源模建的方法分析了肺炎链球菌HMGS的三维结构,为根据肺炎链球菌HMGS同源模建寻找结构类似物来开发新药奠定了基础。
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