HPLC测定蓝萼香茶菜中齐墩果酸和熊果酸的含量

沈晓丹， 袁 杰， 徐乃玉， 李 宁， 张 健，2*

(1.苏州大学药学院，江苏苏州215123;2.苏州利元医药科技有限公司，江苏苏州215011;3.安徽省食品药品检定所，安徽合肥230051)

蓝萼香茶菜Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxin.)Hara为唇形科香茶菜属植物，为民间药，性味苦、寒，具有健胃、清热解毒、活血等功能，用于治疗胃炎，脘腹胀痛，肝炎初期，感冒发热等。蓝萼香茶菜叶中主要含有蓝萼甲素、蓝萼丙素、ent-7β，14α，15β 三羟基-16-贝壳杉烯-3-酮等二萜类成分;木栓酮、乙酰熊果酸、齐墩果酸、熊果酸、2α-羟基熊果酸、2α，3α-二羟基熊果酸等三萜类化合物;及槲皮素、芦丁等黄酮;β-谷甾醇、胡萝卜苷、果糖等其它类化合物。张元桐等采用反相HPLC测得蓝萼甲素含量为1.03%，但未对三萜类成分-齐墩果酸和熊果酸进行含量测定［1-4］。齐墩果酸和熊果酸具有较强的生理活性，齐墩果酸具有保肝、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗高血压、抗炎、抗病毒、免疫凋节、抑制血小板聚集和抗氧化等多种药理作用;熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血糖、抑制癌细胞和肿瘤细胞等作用［5-6］;为此，有必要建立该植物的齐墩果酸和熊果酸的质量控制方法。本实验采用高效液相色谱法建立了同时测定蓝萼香茶菜叶中齐墩果酸和熊果酸含量的方法，为进一步有效控制蓝萼香茶菜的质量提供依据。

1 仪器与试药

岛津LC20A高效液相色谱仪(二元梯度515泵、智能柱温箱、紫外可见检测器SPD-M20A、化学工作站等)。齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110709-200304，供含量测定用);熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110742-200516，供含量测定用);甲醇为色谱纯;水为纯化水;其余试剂均为分析纯;蓝萼香茶菜采自黑龙江省铁力市桃山林业局白河林场(海拨 280.4m;N 46°986′;E128°688′)，经黑龙江中医药大学王振月教授鉴定为蓝萼香茶菜Rabdosia japonica var.glaucocalyx(Maxin.)Hara;标本保存在黑龙江中医药大学标本馆。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 -0.1%磷酸(80∶20);流速:1.0 mL/min;柱温:35℃;检测波长:210 nm。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取齐墩果酸、熊果酸对照品，用甲醇超声溶解配成含0.13 mg/mL齐墩果酸、0.78 mg/mL熊果酸的混合对照品溶液。

2.3 样品溶液的制备 精密称取叶1 g，置于250 mL园底烧瓶，加入25 mL甲醇，回流提取2 h，过滤，回收甲醇，溶解于10 mL水中，石油醚萃取两次，每次20 mL，水层回收至干，25 mL甲醇溶解，过滤，定容至25 mL量瓶中，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。

2.4 系统适用性试验 取熊果酸和齐墩果酸对照品溶液、样品溶液按上述色谱条件，进样20 μL，测得其 HPLC图谱，如图1所示，齐墩果酸和熊果酸的保留时间分别为24.6 min和26.8 min;理论塔板数分别为13 592和12 096;分离度为1.453;符合定量分析的要求。

2.5 线性关系考察 精密量取上述对照品混合溶液0.1、0.3、0.7、1.1、1.5 mL至 5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，各取上述溶液20 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得齐墩果酸线性回归方程为Y=7 756 267 X+10 973，r=0.999 8;熊果酸线性回归方程为Y=7 951 888X+17 163，r=0.999 5;表明当齐墩果酸进样量在2.6～39.0 μg，熊果酸进样量在 1.6 ～23.4 μg之间时，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

图1 蓝萼香茶菜HPLC图谱

2.6 精密度实验 取同一对照品溶液，重复进样5次，每次20 μL，按上述色谱条件测定齐墩果酸和熊果酸峰面积，计算齐墩果酸峰面积的RSD为1.59%，熊果酸峰面积的RSD为1.69%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性实验 按2.3项样品溶液制备方法处理同一样品5份，各吸取20 μL，按上述色谱条件测定，分别测定齐墩果酸和熊果酸峰面积，计算齐墩果酸峰面积的 RSD为1.52%，熊果酸峰面积的RSD为2.20%，表明实验方法重复性良好。

2.8 稳定性实验 取蓝萼香茶菜，依2.3项制备供试品溶液，在 0，2，4，8，12，24 h 各吸取 20 μL，按上述色谱条件测定，测得齐墩果酸的峰面积RSD为1.35%，熊果酸的峰面积RSD为1.14%。实验表明，样品溶液在24 h内基本稳定。

2.9 加样回收率实验 称取5份已知含量的药材各0.5 g，精密称定。分别精密加入含齐墩果酸、熊果酸的混合对照品溶液1 mL(含齐墩果酸1.3 mg，熊果酸2.3 mg)。5份样品按2.3项样品溶液的制备方法处理，依上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

2.10 样品含量测定 精密称取叶、茎各1 g，分别置于250 mL圆底烧瓶，各加入25 mL甲醇，回流提取2 h，过滤，回收甲醇，10 mL水溶解，石油醚萃取两次，每次20 mL，水层回收至干，再用25 mL甲醇溶解，过滤，定容至25 mL量瓶中，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液 。按以上色谱条件进行测定，测得叶中齐墩果酸平均含量0.109 8 mg/g(n=5，RSD=1.92%)，熊果酸平均含量0.143 92 mg/g(n=5，RSD=3.04%);茎中齐墩果酸平均含量0.026 3 mg/g(n=5，RSD=1.58%)，熊果酸平均含量0.028 1mg/g(n=5，RSD=2.66%)。

表1 回收率实验结果(n=5)

3 讨论

3.1 样品液制备方法的优化 齐墩果酸、熊果酸的提取溶剂主要有氯仿、乙醇、乙醚，提取方法有超声法、索式提取法、回流提取法［7-8］。本实验用甲醇作为溶剂，采用超声法、回流方法提取，结果表明回流法效果好，进一步考察去除叶绿素的方法，分别考察石油醚萃取或石油醚先脱脂后提取，结果表明石油醚萃取效果好，同时，采用正交设计，对提取溶剂体积、提取次数、提取时间、石油醚萃取次数、石油醚用量进行考察，确定最佳工艺。

3.2 齐墩果酸、熊果酸互为同分异构体，极性相近，两者不容易分开。本实验通过甲醇-0.1%磷酸以不同比例(75∶25、78∶22、80 ∶20)混合作为流动相，考察其分离度，结果210 nm为检测波长，流速1.0 mL/min，甲醇:0.1%磷酸(80∶20)，样品中齐墩果酸、熊果酸分离较好，故本试验最终确定此色谱条件。

［1］Kim Dongsa，Chang Ryongung，Shen Xiaoyu，et al.Diterpenoids from Rabdosia japonica［J］.Phytochemistry，1992，31(2):697.

［2］张 健，王 冰，张 宁.蓝萼香茶菜的黄酮类成分研究［J］.中草药，2006，37(8):1142-1144.

［3］曹露晔，陈子君.蓝萼香茶菜研究进展［J］.云南中医中药杂志，2004，25(3):42-43.

［4］王福东，丁 兰，汪汉卿.蓝萼香茶菜三萜成分的研究［J］.中国中药杂志，2005，30(24):1929-1932.

［5］王德仁.齐墩果酸研究新进展［J］.天津药学，2003，15(3):56-58.

［6］熊 斌，雷志勇，陈 虹.熊果酸药理学的研究进展［J］.国外医学药学分册，2004，31(3):331-631.

［7］刘小兰，周剑波，陶燕铎，等.高效液相色谱法测定翼首草中齐墩果酸和熊果酸的含量［J］.中国医院药学杂志，2008，28(7):546-548.

［8］黄 丽，陈 彦，贾晓斌，等.不同产地夏枯草中熊果酸和齐墩果酸的含量比较［J］.中成药，2008，30(9):1319-1321.