波尔山羊和山西省地方山羊品种微卫星DNA多态性分析及群体间杂种优势预测

2010-01-30毛杨毅罗惠娣郭慧慧张喜中王志武王栋才张冠武韩一超

中国草食动物科学 2010年4期

毛杨毅,罗惠娣,郭慧慧,张喜中,王志武,李俊,王栋才,张冠武,韩一超,田辉

(山西省农科院畜牧兽医研究所,太原 030032)

山西省是我国养羊大省,具有丰富的山羊品种资源。黎城大青羊、阳城白山羊、吕梁黑山羊[1-2]以及洪洞奶山羊都是山西著名的山羊业的主要生产资料,具有生产性能良好、适应性强、耐粗饲等优良品质。近年来,为适应羊肉生产发展的需要,引入波尔山羊及南江黄羊等与本地品种进行了试验性杂交,以期建立成熟的杂交繁育生产体系,为山西山羊羊肉生产奠定基础。在山羊生产实践中,杂种优势的预测及其利用日益重要,但传统的杂种优势预测需要进行杂交试验和配合力测定,既费时又费力。随着分子生物学技术的发展,基于DNA多态性的分子标记的产生为解决这些问题开创了新的途径。

微卫星是DNA序列中以2～6个短核苷酸为基本单位,重复10～20次,分布于生物整个基因组。因数量多、分布广、多态性丰富、呈共显性遗传以及检测快速方便等优点而倍受推崇,已被广泛应用于遗传连锁图谱构建、数量性状基因定位、遗传多样性评估等方面。此外,微卫星DNA多态性还被应用于动物杂交优势的预测。通过各品种在不同微卫星座位的等位基因频率计算出品种间的遗传距离,了解其血缘关系的远近以预测杂种优势的大小。

在国内其它省区,瞿冬艳等[3]用微卫星DNA对宁夏牧区主要绵羊群体的遗传多态性进行了分析,并据此预测了杂种优势;张英杰等[4]则在利用微卫星DNA分析3个山羊群体和部分绵羊品种遗传多态性的基础上,对预测的杂种优势进行了实际杂交验证。武艳平等[5]用微卫星标记研究我国部分山羊群体遗传结构变异;李步高等[6]、常新建等[7]分别用RAPD技术和微卫星标记分析山西省部分山羊品种和外来部分山羊品种的遗传亲缘关系。但用微卫星标记对山西省4个地方山羊品种及波尔山羊的遗传多样性及亲缘关系进行系统研究未见报道。本研究利用微卫星DNA从分子水平上分析5个山羊品种的遗传多态性,计算了群体间的遗传距离,据此对波尔山羊与4个地方品种间的杂种优势做了预测,旨在为山西省进行山羊杂交改良、新品种培育等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测样品 2008年3—11月,在各品种内采取特征明显的40只羊的耳组织样品,共采集样品200份,放进装有70%～75%酒精的保温壶中带回实验室。其中黎城大青羊(LC)采自黎城县种羊场,阳城白山羊(YC)采自阳城白山羊种羊场,吕梁黑山羊(LL)采自兴县高效生态养羊繁殖示范基地,洪洞奶山羊(HD)采自洪洞奶山羊育种场,波尔山羊(Boer)采自山西省农科院畜牧兽医研究所种羊场。

1.1.2 微卫星座位及引物序列微卫星座位、引物序列、染色体位置等相关信息均来自www.ncbi.nlm.nih.gov和www.marc.usda.gov两个网站,见表1。引物由北京奥科生物技术有限公司合成。

表1 5对微卫星引物的信息

1.1.3 主要试剂 10×buffer、dNTP 、Mg2+、Taq酶、T ris平衡酚、丙烯酰胺等试剂均由太原市来宝生物工程有限公司提供;pBR322 DNA/Msp1由天根生化科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取采用酚-氯仿抽提法[8]。

1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系:反应体系10 μ L,其中各组分的终浓度或剂量分别为:1～2×buffer,dNTPs 100～400μ M,primer 1和primer 2各0.2～0.4 μ M,Mg2+1.5 ～ 2.0 mM,Taq 酶 0.5～ 1.0 u,基因组DNA 20～40 ng。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性 30 s,50～64℃退火 50 s,72℃延伸 1 min,共35个循环;72℃终末延伸5 min。

1.2.3 等位基因分离及大小计算用8%～12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离微卫星等位基因,经硝酸银染色后,用WD-9413A凝胶成像系统拍照保存。再以pBR322 DNA/Msp1 Marker为标准,利用ONE-Dscan软件计算等位基因大小。

1.2.4 数据统计参考引用相关文献[9],对数据进行统计分析。利用 Mstools、Fstat、Popgene、dispan 等软件计算每个品种在各位点等位基因频率(P)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、总群体遗传分化系数(Gst)、品种间标准遗传距离(DS)。

2 结果

2.1 PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳分离将5个山羊品种在5个微卫星位点PCR扩增产物用8%～12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段,PCR产物电泳结果参见图1。从图1可见,PCR产物扩增以及基因分离效果良好。根据等位基因片段大小分别记录为 a、b、c、d……等。

图1 吕梁黑山羊(LL)BM6526位点PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.2 品种的遗传多样性由表2可知,5个微卫星位点在5个山羊品种中共检测到70.0个等位基因,各位点检测到等位基因数9.0～21.0个,平均14.0个。黎城大青羊、阳城白山羊、吕梁黑山羊、洪洞奶山羊、波尔山羊在5个微卫星位点检测到的等位基因数分别为:46.0、37.0、42.0、35.0、36.0个。依据等位基因组成,运用Mstools软件计算等位基因频率。

表2 5个山羊品种各微卫星位点等位基因数

各品种在各位点观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)及平均 Ho、He、PIC、Ne等(表3)的计算,基于等位基因组成及频率,运用Mstools和popgene软件。5个微卫星座位的有效等位基因数3.33～15.46个,平均7.99个。BM6526座位最多,MB056座位最少。5个山羊品种在5个微卫星位点平均有效等位基因数顺序为:黎城大青羊＞吕梁黑山羊＞阳城白山羊＞波尔山羊＞洪洞奶山羊。

利用5个微卫星标记在检测5个山羊品种遗传多态信息含量时,除MB056位点在洪洞奶山羊多态信息含量0.444 6(0.25＜PIC＜0.5)为中度多态位点外,其它PIC＞0.5均为高度多态位点。5个山羊品种在5个微卫星位点平均遗传多态信息含量以黎城大青羊最高,洪洞奶山羊最低。

各微卫星位点基因杂合度在0.701 7～0.937 6之间,BM6526位点较大,MB056位点较小;5个山羊品种在5个微卫星位点平均基因杂合度顺序为:黎城大青羊＞阳城白山羊＞吕梁黑山羊＞波尔山羊＞洪洞奶山羊。此结果与多态信息含量结果相一致。

表3 5个山羊品种在各微卫星位点的有效等位基因数、基因杂合度、多态信息含量

2.3 品种间遗传分化根据等位基因组成及频率,使用popgene、dispan软件,计算出在5个微卫星点在各山羊品种间遗传分化系数(表4)、标准遗传距离(表5)。由表4可知,在5个微卫星位点上,URB037位点遗传分化系数最大(0.080 6),MB056位点最小(0.030 6),平均0.060 7。表明5个微卫星位点上各山羊品种间遗传变异占总群体遗传变异的6.07%,93.93%遗传变异发生在品种内,可见品种间遗传变异不大。

由表5可知,波尔山羊与吕梁黑山羊遗传距离最大(0.508 3),与阳城白山羊(0.447 4)和洪洞奶山羊(0.433 2)次之,与黎城大青羊最小(0.330 1);黎城大青羊与阳城白山羊间遗传距离最小(0.082 0),依次为黎城大青羊、阳城白山羊与吕梁黑山羊(0.107 0)、(0.153 0),吕梁黑山羊、阳城白山羊、黎城大青羊与洪洞奶山羊(0.304 2)、(0.337 4)、(0.353 5),波尔山羊与黎城大青羊、洪洞奶山羊、阳城白山羊、吕梁黑山羊间为最大。

表4 5个微卫星位点的总群体基因多样度(Ht)、群体内基因多样度(Hs)及基因分化系数(Gst)

表5 5个山羊品种间遗传距离

3 讨论

3.1 品种遗传变异分析等位基因是衡量微卫星座位多态性的一个重要参数。根据微卫星标记选择标准,每个微卫星位点至少应有4个等位基因方能较好地用于遗传多样性的评估[10]。本研究结果为:5个山羊品种在各微卫星位点的等位基因数都在4.0个以上,各位点检测到的等位基因数为9.0～21.0个,均比报道的多,说明选择的5个微卫星座位多态性丰富,可用于5个山羊品种遗传多样性的评估。

有效等位基因数(Ne)、基因杂合度(H)、遗传多态信息含量(PIC)都是衡量品种内遗传变异程度及座位多态信息量的指标[11]。赵艳红等[12]、武艳平等[5]、常新建等[7]、王杰等[13]、潘建文等[14]用微卫星标记分别分析了中国部分山羊群体及山西、四川、福建省部分地方山羊品种的遗传多样性,结果为:中国6个山羊群体平均有效等位基因数为2.571～4.915个,平均多态信息含量在0.533 0～0.639 0之间,平均遗传杂合度在0.367 0～0.467 0之间;我国5个山羊品种平均有效等位基因数为4.66～6.05个,平均多态信息含量在0.724 0～0.784 0之间,平均遗传杂合度在0.768 0～0.820 0之间;5个山羊群体平均有效等位基因数为7.776 5～11.506 0个,平均多态信息含量在0.834 1～0.902 6之间,平均遗传杂合度在0.859 4～0.911 5之间;四川9个黑山羊品种平均有效等位基因数4.273～5.281个,平均多态信息含量在0.697 0～0.770 0之间,平均遗传杂合度在0.742 0～0.801 0之间;福建地方山羊品种平均有效等位基因数4.46～5.60个,平均多态信息含量在0.729 4～0.780 8之间,平均遗传杂合度在0.767 2～0.807 9之间。本研究的结果为:5个山羊品种平均有效等位基因数为4.94～6.05个,平均遗传多态信息含量在0.705 3～0.798 2之间,平均基因杂合度在0.759 2～0.831 6之间。可见本研究结果与武艳平等[5]、王杰等[13]、潘建文等[14]的结果相似,略高于赵艳红等的结果[12],略低于常新建等的结果[7]。结果表明,5个山羊品种遗传变异程度高、多态性丰富及选择潜力大;5个微卫星位点均为高度多态位点、多态信息量大,能够从分子水平上反映5个山羊品种内遗传变异及品种间遗传关系,可作为有效遗传标记用于山羊品种的遗传多样性及系统发生树的构建分析。

另外,在5个山羊品种中,黎城大青羊的平均有效等位基因数、基因杂合度、多态信息含量3项指标最大,而洪洞奶山羊最小,表明黎城大青羊的遗传变异程度较其它4个山羊品种大,而洪洞奶山羊则小。这可能是洪洞奶山羊目前数量较少、遗传资源不广泛造成的原因。

3.2 品种间亲缘关系分析遗传距离是度量品种间、物种间遗传变异及基因差异程度的某种数值。李步高等[6]、常新建等[7]分别用RAPD技术、微卫星标记研究波尔山羊与山西部分地方山羊品种间遗传距离,结果均为波尔山羊与吕梁黑山羊间遗传距离大于与黎城大青羊间遗传距离。本实验结果:波尔山羊与山西4个地方山羊品种间标准遗传距离(DS)顺序为:波尔山羊与吕梁黑山羊＞波尔山羊与阳城白山羊＞波尔山羊与洪洞奶山羊＞波尔山羊与黎城大青羊。此结果与李步高等[6]、常新建等[7]研究结果基本一致。

3.3 杂种优势推测杂种优势理论认为[15],杂种优势的大小在一定程度上取决于亲本间的遗传差异大小,即亲本间遗传距离。遗传距离越大,遗传分化越大,杂交优势越大,杂交效果越好。瞿冬艳等[3]用微卫星标记分析宁夏牧区主要绵羊群体间遗传距离,并预测杂种优势;张英杰等[4]在用微卫星DNA分别进行3个山羊群体间、5个绵羊品种间遗传距离分析的基础上,对预测的杂种优势做了实际杂交验证。李步高等[6]用RAPD技术对波尔山羊与山西部分地方山羊品种间遗传距离进行研究,得出波尔山羊与吕梁黑山羊的杂种优势较与其它几个品种大。据本研究结果,波尔山羊与吕梁黑山羊杂交,可望获得较大的杂种优势,与阳城白山羊和洪洞奶山羊的杂种优势次之,与黎城大青羊的杂种优势较小。此结果与李步高等[6]研究结果基本一致。

致谢:黎城县种羊场、阳城白山羊种羊场、兴县高效生态养羊繁殖示范基地、洪洞奶山羊育种场的同仁们对本文采集样品的支持。

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