上海2009甲型H1N1流行性感冒病毒全基因组分析

宋志刚，田棣，张小楠，任广旭,2，周志统，何静，袁正宏,2，胡芸文

1. 上海市(复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海201508； 2. 复旦大学上海医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海200032

2009年春夏之际，一种新型H1N1甲型流行性感冒(简称流感)在全球流行。此流行始于墨西哥，迅速传播到美国、加拿大等北美国家，之后引起全球范围内的暴发。同年5月11日，中国内地确诊第1例新型甲型H1N1流感病例。5月24日，上海地区发现第1例输入型甲型H1N1流感病例。该新型病毒含有目前所知的4种甲型流感病毒的基因片段[1]，且全球人群普遍缺乏针对该病毒的免疫力。

由于大部分甲型H1N1流感症状与季节性流感(H3N2、H2N1等)相似，而且流感病毒易在人群传播中发生基因变异，导致抗原性和耐药性改变，因此需要对甲型H1N1流感病毒进行病原学的严密监测。本研究从上海地区较早发现的2例输入型甲型H1N1流感病例中分离并鉴定了2株病毒株，探讨其基因特点和生物学特征，为上海地区开展病毒监测和科研工作提供参考。

1 材料和方法

1.1 患者及样本收集

2例输入型甲型H1N1流感患者，其中1例男性患者于2009年5月24日确诊为甲型H1N1流感，另1例女性患者于2009年5月29日确诊为甲型H1N1流感，均住院治疗。患者的临床症状和体征见表1。2例患者均接受奥司他韦(oseltamivir)治疗，每日2次，每次75 mg，共服药5 d，1周后康复出院。患者住院期间，每日早晨取鼻咽拭子，放入病毒维持液内，制成标本悬液，立即送实验室进行病毒检测。

1.2 病毒分离培养

2例患者的咽拭子标本悬液800 μl分别接种至单层犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cell，MDCK细胞)上，37 ℃孵育30 min，再补入8 ml DMEM培养液(含100 u/ml 青霉素、100 μg/ml链霉素和3 μg/ml TPCK-胰酶)，37 ℃、5% CO2中培养。观察细胞形态，并每隔3～5 d取培养上清液传代。当细胞出现可识别的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)时，用实时荧光反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测培养上清液中的病毒核酸。用终点法滴定计算每0.1 ml培养上清液中的半数组织培养感染剂量(50% tissue culture infective dose，TCID50)。

表12例甲型H1N1流感患者的资料和症状

Tab.1CharacteristicsandsymptomsoftwopatientsconfirmedasinfluenzaA(H1N1)

CharacteristicPatient 1Patient 2 Age 3022GenderMaleFemaleRecent history of travel to epidemic areasMelbourne (Australia)New York (USA)ProfessionBusinessmanStudentClinical symptoms Fever39.2 ℃38.2 ℃ CoughYesYes Sore throatYesYes DiarrheaNoNo VomitingNoNoHospitalizationYesYesInfiltration on chest radiographNoNoAdmitted to intensive care unitNoNoRespiratory failure requiring mechanical ventilationNoNoOseltamivir treatmentYesYesFull recoveryYesYesVaccinated with influenza vaccine during 2008-2009NoNo

1.3 RNA提取和实时RT-PCR检测

用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)提取样本中病毒RNA，按照试剂盒操作步骤进行。取样本140 μl，加入含Carrier RNA的裂解液560 μl，室温放置10 min；加入560 μl乙醇后混匀，用柱子吸附RNA，依次加入缓冲液AW1和AW2洗涤2次；最后用60 μl AVE缓冲液溶解RNA，-80 ℃保存备用。按美国疾病预防控制中心推荐的方法进行甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测。参考世界卫生组织(World Health Organization，WHO)流感检测方法设计实验引物 (http://www.who.int/csr/ resources/ publications/ swineflu/ realtimeptpcr/en/ index.html)。用一步实时荧光定量RT-PCR体系[2](Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative Kit)鉴定该流感病毒，反应条件为50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，在延伸过程中采集荧光信号。

1.4 免疫荧光检测

在培养MDCK细胞的培养皿中放入盖玻片，24 h后接种病毒，37 ℃、5% CO2孵育72 h；3%聚合甲醛室温固定10 min，并用0.1% Triton X-100穿膜。一抗来自甲型流感患者恢复期血清，二抗为藻红素标记的抗人IgG(P8047，Sigma，1∶200稀释)或FITC标记的抗人IgG。细胞与抗体孵育后，在Olympus FV1000共聚焦显微镜下观察细胞形态和荧光。

1.5 电子显微镜下观察病毒

收集培养流感病毒的MDCK细胞液，置-80 ℃冻存2 h，37 ℃ 融化，反复冻融3次。取冻融液10 ml，1 600g离心10 min，去沉淀物。上清液以130 000g离心90 min，去上清液。沉淀物重悬后滴在有支持膜的网上，负染缓冲液(含2%的2.5 mmol/L磷钨酸，pH 7.0)染色2 min，扫描透射电子显微镜(Philips CM20)成像。

1.6 核酸测序

一步法RT-PCR[2]扩增病毒基因组的8个基因片段并测序。扩增引物参考文献报道[1]。采用ABI 3730XL测序系统(Applied Biosystems)测序，软件VECTOR NTI version 8.0整理测序数据，以A/Carifonia/04/2009(H1N1)全长基因序列作为参考序列。

1.7 系统发生树分析

将分离到的2株病毒全基因序列与来自人甲型流感和猪流感的代表性毒株(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)进行对比，构建系统发生树。系统发生树的绘制采用邻位连接法(neighbor-joining)和最大组成似然模型(maximum composite likelihood)法。发生树的可靠性通过1 000 replications的bootstrap验证。

2 结果

2.1 RT-PCR检测病毒

取2例流感患者的鼻咽拭子标本悬液，在入院第1、2天检测病毒核酸，结果均为阳性；但从第3天起直至出院，检测结果均为阴性。

2.2 病毒分离

取2例流感患者鼻咽拭子标本悬液，分别接种至MDCK细胞，连续传3代后，可观察到细胞变圆、聚集和从壁上脱离等细胞病变效应(图1B、C)。实时RT-PCR法检测到培养上清液中存在病毒颗粒。分别命名病毒株为A/Shanghai/37T/2009(H1N1) 和 A/Shanghai/71T/2009(H1N1)，以下简称37T和71T。细胞培养上清液中的病毒滴度分别为3 200 TCID50/ml和2 545 TCID50/ml。

2.3 免疫荧光检测确认细胞内病毒复制

用免疫荧光染色法对细胞染色，共聚焦显微镜下可见未感染病毒的MDCK细胞中无荧光，如图2A、B所示。病毒感染72 h后的MDCK细胞质内出现红色荧光，呈清晰点状分布，如图2C、D所示。

A: Uninfected control monolayers after 72 h. B, C: Infected monolayers 48 and 72 h after inoculation, respectively.

图137T株感染MDCK细胞的病变效应(×40)

Fig.1Cytopathiceffectinducedby37TinMDCKcells(×40)

A：Uninfected MDCK cells. B：Immunofluorescence imaging of uninfected MDCK cells. C：MDCK cells infected by influenza A virus subtype H1N1. D：Immunofluorescence imaging of MDCK cells infected by influenza A virus subtype H1N1.

图2免疫荧光染色和共聚焦分析

Fig.2Immunofluorescencestainingandconfocalmicroscopyanalysis

2.4 电子显微镜观察病毒颗粒形态

37T毒株的扫描透射电子显微镜照片显示，该病毒呈球状，有包膜，颗粒直径60～80 nm，包膜表面有突起围绕，呈现正黏病毒颗粒形态特征(图3)。

Scale bar, 200 nm.

图3扫描透射电子显微镜下的病毒颗粒

Fig.3Transmissionelectronmicrographofnegativelystainedviralparticlesshowingtypicalorthomyxovirusparticleswitharegularfringeofsurfaceprojection

2.5 病毒核酸序列和氨基酸序列分析

分别对37T和71T毒株的全部8个基因片段(包括PB1、PB2、PA、HA、NA、NS、NP和M基因)进行扩增和测序，并在GenBank中注册。37T的8个基因片段的GenBank编号分别是GQ253489、GQ253490、GQ253491、GQ253492、GQ253493、GQ253494、GQ253495和GQ253496。71T 的8个基因片段的GenBank编号分别是GQ253497、GQ253498、GQ253499、GQ253500、GQ253501、GQ253502、GQ253503 和GQ253504。对比37T和71T的全基因核酸序列与参考株A/California/04/2009(H1N1)的序列，同源性分别为99.79%和99.81%，各基因片段序列与A/California/04/2009(H1N1)株也具有高度的同源性(表2)，与输入型甲型流感的判断吻合。

表2上海分离株与参考株核酸序列的相似度

Tab.2Nucleotidesequencesimilarityof37Tand71TcomparedwithreferencestrainA/California/04/2009(H1N1)

GeneRangeA/Shanghai/37T/2009(H1N1)A/Shanghai/71T/2009(H1N1)PB21-228099.78%(5)99.82%(4)PB11-227499.91%(2)99.91%(4)PA1-215199.91%(2)99.91%(2)HA1-170199.59%(7)99.71%(5)NA1-141099.79%(3)99.79%(3)NS1-83899.62%(3)99.88%(1)NP1-149799.80%(3)99.80%(3)M1-97299.80%(2)99.80%(2)

The data in the parenthesis mean the number of nucleotide differences.

将2株病毒的氨基酸序列与参考株序列进行对比，同源性分别为99.75%和99.77%。其中 PB1和M蛋白没有氨基酸差异，但PB2、PA、HA、NA、NP、NS1和NS2蛋白的氨基酸序列分别有11个(37T)和10个(71T)氨基酸差别(表3)。

进一步对耐药相关位点氨基酸(金刚烷胺和奥司他韦)的分析表明，37T和71T病毒株与参考株的耐药位点氨基酸相同，即M2蛋白氨基酸序列中,金刚烷胺类药物的耐药位点第31位[3]由敏感型的丝氨酸(S)突变为抗药型的天冬酰胺(N)，而NA蛋白氨基酸序列与奥司他韦作用相关的第119、152、275、293和295位点氨基酸残基分别为谷氨酸(E)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、精氨酸和天冬酰胺，未发生点突变。

表3上海分离株与参考株的氨基酸突变

Tab.3Aminoacidmutationsamongthereferencestrain,37Tand71T

Viral proteinAmino acid siteA/California/04/2009(H1N1)A/Shanghai/37T/2009(H1N1)A/Shanghai/71T/2009(H1N1)PB2703RRKPA224PSSHA100PSS214TAA220STT338IVV428VIVNA106VII248NDNNP100VIINS1123IVVNS273RKK

2.6 系统发生树分析

用HA、NA 和PB2的核苷酸序列分别构建系统发生树，结果显示，37T和71T的HA基因与典型的猪流感病毒位于同一簇内，具有较近的亲缘关系，与人季节性H1N1流感病毒和欧亚系猪流感病毒的亲缘关系较远(图4A)；而NA基因与欧亚系(禽样)猪流感病毒位于同一簇内，具有较近的亲缘关系，与人季节性H1N1流感病毒和经典猪流感病毒的亲缘关系较远(图4B)；PB2基因与猪H1N2、H3N2和人H1N1位于同一簇内，具有较近的亲缘关系，但与人季节性H1N1流感病毒、经典猪流感病毒和欧亚系猪流感病毒的亲缘关系较远(图4C)。

3 讨论

2009甲型H1N1流感疫情在北美暴发后的几个月内，中国大部分省市包括北京、广东和上海等均陆续出现确诊病例。本研究从2例上海确诊的甲型H1N1流感患者体内，成功分离到2株病毒(37T和71T)。在电子显微镜下呈球状，有包膜，直径60～80 nm，包膜表面有突起围绕，基本符合流感病毒的特征。进一步的免疫荧光结果显示，病毒存在于MDCK细胞质中；核酸检测结果显示该病毒可能是甲型H1N1病毒。

目前有两类抗流感病毒的药物[4]：一类是抑制M2蛋白的药物，如金刚烷胺；另一类是神经氨酸酶抑制剂类，如奥司他韦[5]。奥司他韦对甲和乙型流感病毒均有效，且临床不良反应小。一般来说，季节性甲型H1N1流感对金刚烷胺敏感；而2009甲型H1N1流感对金刚烷胺耐药，其M2蛋白氨基酸序列中，耐药位点第31位[3]由敏感型的丝氨酸突变为抗药型的天冬酰胺。 本研究中37T和71T病毒基因测序结果发现，金刚烷胺耐药位点有改变，奥司他韦敏感性相关位点[6,7]无基因突变现象。患者在使用奥司他韦治疗2 d后，标本中病毒核酸即转阴，说明该病毒对奥司他韦敏感。因此，此2株病毒基因型与病例临床表型是相符的，也与2009甲型H1N1流感病毒的耐药特征相一致。

本实验中采用康复期患者血清作为抗体进行免疫荧光检测，发现该血清与病毒有较强的反应性，提示患者在感染后短期内可能产生了2009甲型H1N1流感病毒的IgG抗体。另一种可能的解释是，2009甲型H1N1流感病毒感染后能激活宿主体内针对既往季节性流感病毒的记忆性T细胞，产生的抗体与本次流行株存在交叉反应。吴迪[8]等对HA蛋白的同源建模分析发现，2009甲型H1N1流感病毒HA1蛋白与人季节性流感(H3N2)、禽流感病毒和猪流感病毒HA蛋白的同源性达40%～84%，HA2蛋白与上述流感病毒HA蛋白的同源性达63%～92%。因此，针对季节性流感的抗体与2009甲型H1N1流感病毒起交叉反应的推测有一定的理论依据，但须通过实验进一步证实。

本研究发现，在系统发生树中，37T和71T病毒的HA、NA、PB2基因分别与典型的猪流感病毒HA基因，欧亚系(禽样)猪流感病毒NA基因，猪H1N2、H3N2和人H1N1的PB2基因具有较近的亲缘关系，与先前研究报道[1,9]相似。经DNA序列对比分析发现，37T和71T病毒只有很少的核酸发生突变，从氨基酸序列上未发现此2株流感病毒与A/California/04/2009(H1N1)参考株在生物学特性、耐药性和抗原性方面存在显著差异，与2009甲型H1N1流感病毒株的研究报道[10]相符合，表明此2株病毒与2009甲型H1N1流感病毒可能为同一来源。

与以往季节性流感相比，流行于 2009年春夏和秋冬季的甲型H1N1流感病毒的传播性更强，并易在肥胖者、孕妇等特定人群中引起重症感染[11]。目前，国内、外研究还未能很好解释上述现象，因此对2009甲型H1N1流感病毒的生物学特性仍需继续观察，其重症发病机制仍需进一步深入研究。

A：HA. B: NA. C: PB2.

The phylogenetic trees made from the two isolated strains (▲) and representative selected strains were generated by using MEGA 4.0 with the neighbor-joining method and bootstrap resampling (1 000 replications). The numbers at each branch represent the bootstrap value (below 60% is not shown). The evolutionary distances were computed by using the maximum composite likelihood method and are in the units of the number of base substitutions per site.

图4上海分离株与相关参考株的HA、NA、PB2基因核苷酸序列系统发生树

Fig.4PhylogenetictreesfornucleotidesequencesofHA,NAandPB2genesof37T,71Tandreferencestrains

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