鼓室硬化豚鼠中耳黏膜电镜下超微结构特点

万良财 李琰 谢南屏 李永贺

鼓室硬化(tympanosclerosis)是指中耳黏膜固有层发生的钙化病变，系中耳黏膜慢性感染或炎症的结果,目前鼓室硬化的发病机理还不十分明了。为了解豚鼠鼓室硬化中耳黏膜的超微结构特点及进一步了解豚鼠鼓室硬化的发病机理，本研究对鼓室硬化造模成功的豚鼠中耳腔不同部位黏膜组织行电镜观查，报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康杂色豚鼠8只，雌雄不拘，体重为250～350 g，排除外耳道、鼓膜、中耳等感染。其中6只(8耳)行鼓室硬化造模(鼓室硬化组)，2只(4耳)为正常对照组(对照组)。

1.2鼓室硬化豚鼠造模方法 受试豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠(35 mg/kg)施行全身麻醉，安尔碘消毒双耳及外耳道皮肤，用1 ml无菌注射器抽取1×108个/L金黄色葡萄球菌液100 μl，显微镜下经鼓膜紧张部后下象限向鼓室内注射，观察6个月以上,观察期间不行任何治疗[1]。造模成功标准:显微镜下鼓膜穿孔边缘或鼓室腔可见钙化斑。

1.3中耳黏膜取材 将鼓室硬化组及对照组豚鼠分别以1%戊巴比妥钠(35 mg/kg) 腹腔注射麻醉，往听泡内注入2．5%戊二醛1～2 ml，断头处死豚鼠，快速取出听泡。使用耳科电钻磨开听泡，显微镜下剥取中耳，分别取咽鼓管、鼓室、鼓岬、鼓窦、乳突气房5处黏膜组织。

1.4电镜标本的制备 将固定液及所用容器预冷后，在1分钟内将所取中耳黏膜组织切成2 mm×2 mm×1 mm大小，浸入2.5﹪戊二醛固定液中固定3小时(前固定)，经0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)漂洗后予2﹪四氧化锇固定2小时(后固定)，经0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2)漂洗；30﹪酒精脱水8分钟，50﹪酒精脱水8分钟，70﹪酒精脱水8分钟，90﹪酒精脱水12分钟，100﹪酒精脱水3次，每次12分钟，行梯度脱水；脱水剂:包埋剂=1:1，1小时；脱水剂:包埋剂=1:2，2小时；纯包埋剂，5小时；将标本转入塑料囊，70 ℃，10小时，Epon812环氧树脂包埋；超薄切片，面积约0.2～0.3 mm2；予醋酸铀及柠檬酸铅染色，在干净培养皿内放置蜡板，把醋酸铀染液滴在蜡板上，将捞有切片的铜网覆于染液上30分钟，然后用双蒸水冲洗﹑吸干。再铜网覆于柠檬酸铅染液上10分钟，然后用双蒸水冲洗﹑吸干后电镜下观察。

2 结果

正常豚鼠中耳黏膜由上皮细胞及上皮下层组成, 上皮下层结构主要有胶原纤维、纤维细胞，胶原纤维少,排列较整齐；纤维细胞形态大小正常，胞核中染色质染色浅且均匀,粗面内质网、线粒体形态正常,见线粒体嵴，无溶酶体，上皮层及上皮下层均未见钙质沉着(图1)。鼓室硬化豚鼠中耳不同部位黏膜均见变性的成纤维细胞散在分布,成纤维细胞不规则变形、伸长、变性，胞核形状不规则，胞核含深染且染色不均匀的染色质, 异染色质常聚集分布于核周边。在核周的细胞浆内有较多的变性的溶酶体及肿胀的线粒体，线粒体嵴消失，溶酶体染色较线粒体深，线粒体和溶酶体内均可见钙质沉着。细胞浆内可见张力丝和内质网,粗面内质网大部分扩张成圆球状或椭圆囊状,另外，细胞浆内还可见中心体。细胞基质见胶原纤维显著增生，各个方向上均可见，交叉成网或互相平行呈半螺旋形排列，其内含大量无定形的富含电子小囊泡，伴或不伴钙化,有时可因浓聚而呈现空影(图2)。

图1正常豚鼠中耳黏膜电镜图纤维细胞形态正常,线粒体、内质网形态正常,胶原纤维少,未见钙化(×50 000)(1a)。 胞核染色均匀,胞浆内见大量线粒体、内质网,未见溶酶体及钙化(×40 000)(1b)
图2鼓室硬化豚鼠中耳黏膜电镜图伸长退变的纤维细胞及大量胶原纤维，溶酶体、线粒体、细胞基质小囊泡见钙化(×15 000)(2a)。大量胶原纤维增生，内质网扩张成囊状,溶酶体、线粒体见钙化(×25 000)(2b)

3 讨论

鼓室硬化是中耳黏膜长期受慢性炎症刺激的结果，目前人的鼓室硬化的研究已较深入，通常认为与遗传因素、高钙血症、氧自由基﹑钙通道异常等因素有关[2～5]。Wielinga等[6]认为鼓室硬化发生可分为三个阶段，即：黏膜胶原纤维分解、透明斑块形成、钙化发生。人鼓室硬化中耳黏膜电镜特点已有报道[7],但鼓室硬化豚鼠中耳黏膜的透射电镜特点少见文献报道。Mann等[8]认为豚鼠中耳黏膜类似于人中耳黏膜，由上皮细胞及上皮下层组成,上皮下层结构主要有胶原纤维、毛细血管、淋巴管和神经，主要的细胞成分是纤维细胞，偶尔也可见到肥大细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞。

从文中结果看，豚鼠鼓室硬化中耳黏膜成纤维细胞的粗面内质网大部分扩张成圆球状或椭圆囊状,这可能与成纤维细胞的变性有关。细胞基质胶原纤维显著增生，部分区域电镜下可呈岛状改变，这可能与该区域胶原纤维降解破坏有关，这一特征与人鼓室硬化中耳黏膜透射电镜特点非常相似[1]。另外与对照组显著不同的是鼓室硬化黏膜成纤维细胞外有脂肪颗粒，在胶原纤维束间大量内含无定形的富含电子小囊泡常位于靠近基底膜的上皮下层。Mann等[8]认为小囊泡有部分来源于溶酶体。在某些特定的情况下，如感染或创伤可导致细胞钙离子浓度异常增高而损害细胞并伴有溶酶体释放至胞外，而胞外含碱性磷酸酶的小囊泡在钙化过程中起重要作用，它是钙化斑的结晶中心，钙化斑是由磷酸钙结晶形成的。本研究发现豚鼠鼓室钙化可发生于胞内外，胞外通常好发于细胞基质小囊泡；胞内通常发生于线粒体、溶酶体及脂质颗粒内的磷脂结构。

鼓室硬化通常是由于中耳结缔组织长期受炎症刺激而发生的营养不良性钙化。陈杰等[9]认为细胞内钙化起始于坏死细胞的线粒体,当细胞损伤后膜通透性增加,钙离子内流增加，线粒体摄取钙也增加；而细胞外钙化则始于小囊泡内来源于变性细胞的磷脂,钙在这些小囊泡内通过同小囊泡膜的磷脂结合而被浓缩，磷脂经磷脂酶降解形成磷酸盐。损伤和坏死组织中变性的蛋白质极易与磷酸盐离子结合,再与钙离子形成磷酸钙沉淀。另外Mann等[10]通过用钙拮抗剂抑制鼓室硬化发生的实验研究得出：当中耳受炎症等刺激后,细胞膜受损，细胞内的三磷酸腺苷池会耗竭，细胞钙超载导致细胞坏死，结果细胞内的基质小胞会释放到细胞外间隙中成为钙化形成的中心，细胞外基质小囊胞具有钙亲和力，使之成为上皮下钙化的结晶中心。本研究电镜下所见中耳黏膜钙化通常发生的部位也证实了上述观点。

本研究结果显示，豚鼠鼓室硬化超微结构与人鼓室硬化超微结构极相似，细胞内及胞间基质均有钙化。本研究动物模型为研究人鼓室硬化发病机理提供了较好的模型。

4 参考文献

1 李琰，谢南屏，万良财.鼓室注射金葡菌致豚鼠鼓室硬化动物模型的建立[J].南方医科大学学报，2007，27:1 784.

2 Koc A, Uneri C. Genetic predisposition for tympanosclerotic degeneration[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol， 2002 ，259：180.

3 de Carvalho Leal M， Ferreira Bento R，da Silva Caldas Neto S，et al. Influence of hypercalcemia in the formation of tympanosclerosis[J].Otol Neurotol，2006，27：27.

5 Selcuk A, Akdogan O, Ozcan I, et,al. Topical application of calcium channel blockers to reduce the progression of experimentally induced myringosclerosis and tympanosclerosis[J]. Laryngoscope，2008，118:697.

6 Wielinga EW, Kerr AG.Tympanosclerosis[J]. Clin Otolaryngol, 1993, 18：341.

7 万良财，郭梦和，谢南屏，等.鼓室硬化患者中耳黏膜及硬化灶组织病理学特点[J].听力学及言语疾病杂志，2009，17：351.

8 Mann W. Experimental tympanosclerosis following infectionwith Streptococcus pyogenes and vitamin D3 intoxication[J].Arch Otorhinolaryngol，1986，243： 296.

9 陈杰，李甘地.细胞、组织的损伤[M].见:陈杰,主编.病理学.北京：人民卫生出版社，2005.22～30.

10 Mann W,Beck C,Schaefer HE.The significance of calcium antagonists in rat experimental tympanosclerosis[J].Arch Otorhinolaryngol，1987,243：382.