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Folin-Ciocalteu比色法测定花椒中多酚含量的研究

2010-01-24吴亮亮石雪萍张卫明

中国野生植物资源 2010年6期
关键词:大红袍定容蒸馏水

吴亮亮,石雪萍,张卫明

(1.南京野生植物综合利用研究院,江苏南京 210042;2.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

花椒属 (ZanthoxylumL.),属芸香科 (Rutaceae),全世界约有 250种,分布于亚洲、美洲、非洲及大洋洲的热带和亚热带地区。我国约有 45种,13个变种,在我国大面积人工栽培的品种主要为青椒(Z.schinifoliumSieb.et Zucc.),又名青川椒、崖椒、野椒、香椒子和花椒 (Z.bungeanumMaxim.)又名川椒、秦椒、蜀椒、大红袍等[1]。花椒的乙醇提取物具有较强的抗氧化能力,主要原因可能与含有酚类、黄酮类和生物碱类等物质有关[2]。目前对花椒中多酚化合物的定量测定尚未见报道。为了更深入的研究花椒抗氧化作用,本研究采用 Folin-Ciocalteu比色法对花椒的多酚含量的进行了测定,并对常见几种花椒多酚含量进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料:茂汉大红袍、韩城大红袍、云南青花椒及四川青花椒。市售。

试剂:Folin-Ciocalteu试剂 (钼酸钠、钨酸钠、85%浓磷酸、37%浓盐酸、硫酸锂、液溴)、10%Na2CO3、均为国产分析纯;对照品没食子酸,化学纯,上海国药试剂有限公司。

仪器:T6紫外 /可见光分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司);HH-4数显恒温水浴锅 (金坛市江南仪器厂);高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司);SHB-ⅢA循环水式多用真空泵 (河南省泰康科教仪器厂);KQ3200E型超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

将茂汉大红袍、韩城大红袍、四川青花椒及云南青花椒果皮粉碎,过 40目筛。各称取 1 g,用 30 mL 60%的乙醇于 25℃条件下,超声 0.5 h提取,过滤收集提取液。

1.2.2 Folin-Ciocalteu试剂配制[3]

在 1L磨口回流装置内加入 50 g钨酸钠,12.5 g钼酸钠,350 mL蒸馏水,25 mL 85%浓磷酸及 50 mL 37%浓盐酸,充分混匀以小火回流 10 h,加入 75 g硫酸锂,25 mL蒸馏水,数滴溴水,然后开口继续加热至沸,维持 15 min,驱除多余的溴,溶液呈金黄色,冷却后补足蒸馏水至 500 mL,置于冰箱中长期冷藏备用,临用时稀释 1倍。

1.2.3 样品测定

准确吸取 0.1 mL样品液于 100 mL容量瓶中,加入 50 mL蒸馏水,再加入 4 mL Folin-Ciocalteu试剂摇匀,静置 4~5 min,加入 8 mL 10%Na2CO3,用蒸馏水定容,置于 25℃的恒温水浴锅中 120 min,显色后于最大波长下测定吸光度。由标准曲线查得相对应的浓度,并按下列公式计算出多酚的含量。

式中,ω为多酚含量 (mg/g);C为没食子酸质量浓度 (μg/mL);V为提取液体积 (mL);N为稀释倍数;M为取样量 (g)。

2 结果与分析

2.1 吸收波长的选择

准确吸取 0.5 mL浓度为 100μg/mL的没食子酸标准溶液和 4 mL Folin-Ciocalteu试剂于 10 mL容量瓶中摇匀,静置 4~5 min,加入 5 mL 10%Na2CO3,摇匀置于 25℃的恒温水浴锅中 120 min,用蒸馏水定容,显色后置于紫外可见分光光度计中,在波长 600~900 nm范围内进行扫描,结果见图2。

图2 标准品的紫外扫描图谱

在 600~900 nm之间,吸收随着波长的增大先增大后减少,在 765 nm处吸光度最大。因此选择765 nm作为多酚含量测定的检测波长。

2.2 标准曲线的制作[4]

用蒸馏水溶解 0.1 g没食子酸,定容至 100 mL,得 1.0 mg/mL没食子酸溶液。分别移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL到 100 mL容量瓶中 ,加入 50 mL蒸馏水,加入 4 mL Folin-Ciocalteu试剂摇匀,静置 4~5 min,加入 8 mL 10%Na2CO3,用蒸馏水定容,置于 30℃的恒温水浴锅中 120 min,显色后于765 nm波长下测定吸光度,可得浓度与吸光度的曲线。

图1 标准曲线

如图1所示,没食子酸在浓度为 1~6μg/mL内,与其吸光度呈良好的线性关系,在此范围内的线性回归方程为 y=0.1315x+0.0225,相关系数 R2=0.993 8。

2.3 Folin-Ciocalteu试剂与 10%Na2CO3比例的选择

准确吸取 0.1 mL样品 (茂汉大红袍)于 100 mL的容量瓶中定容,加入 50 mL蒸馏水,再加入 2 mL Folin-Ciocalteu试剂摇匀,静置 4~5 min,加入不同体积的 10%Na2CO3,使 Folin-Ciocalteu试剂与10%Na2CO3体积之比分别为 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4,用蒸馏水定容,置于 25℃的恒温水浴锅中 120 min,显色后于 765 nm波长下测定吸光值。结果见图3。

图3 试剂比例与吸光度的关系

2.4 反应时间的选择

准确吸取 0.1 mL样品 (茂汉大红袍)于 100 mL的容量瓶中定容,加入 50 mL蒸馏水,再加入 4 mL Folin-Ciocalteu试剂摇匀,静置 4~5 min,加入 8 mL的 10%Na2CO3,用蒸馏水定容,置于 25℃的恒温水浴锅中反应 30~150 min,显色后于 765 nm波长下测定吸光度。结果见图4。

图4 反应时间与吸光度的关系

随着反应时间的延长,吸光度先增大,120 min之后增加不明显,曲线变得平坦,因此选择 120 min作为花椒多酚含量测定的操作条件。

2.5 四种花椒多酚含量比较

按照 1.2.4方法对四种花椒提取液进行多酚测定,结果见图5。

图5 不同花椒品种多酚含量

由图5可知,四川青花椒的多酚含量最高,达68.7 mg/g,其次是韩城大红袍 67.9 mg/g。云南青花椒 62.7 mg/g,茂汉大红袍 61.5 mg/g。

3 结 论

以没食子酸为标准品,采用 Folin-Ciocalteu比色法测定花椒多酚含量时,多酚含量在 1~6μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。通过对四种不同种类花椒多酚含量的测定可知,不同种类花椒中多酚含量各不相同,其中四川青花椒多酚含量最高,可达 68.7 mg/g。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1981.

[2] 豆海港,陈文学,仇厚援,等.花椒提取物抗氧化作用研究[J].食品研究与开发,2006,27(7):14-16.

[3] SI NGLETON V L,ROSSIJ A.Colorimetry of total phenolics with phosphomoly bdic-phosphotungstic acid regents[J].Am J Enol Vitic,1965,16:144-158.

[4] 王岸娜,徐山宝,刘小彦,等.福林法测定猕猴桃多酚含量的研究[J].食品科学,2008,29(7):398-401.

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