山蕗菜根酶活性的初步研究

杨 辉,王 鸿,邓泽元,范亚苇,李 静

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,高等研究院,江西南昌 330047)

山蕗菜,中文学名掌叶蜂斗菜 (Petasites tricholobus A.Gray),系菊科蜂斗菜属植物,广泛分布于我国西北、西南地区。山蕗菜原是一种野生蔬菜,食用部分为叶柄,一般于夏、秋季采挖根基,鲜用或晒干。蜂斗菜“苦辛,凉”,可“治扁桃体炎,痈肿疗毒,毒蛇咬伤”,“消肿止痛,解毒祛癖,治跌打损伤”[1]。山蕗菜根中除了含有倍半萜内酯、三萜类化合物[2]、粗纤维、挥发油等以外,还含有丰富的多糖类化合物。人工种植的山蕗菜根须布满全田,根须每公顷可达 22.5 t左右,有的还达到 30 t以上。因此,作为一种传统中草药,山蕗菜根资源开发利用潜能巨大。

植物采摘后,体内的酶催化作用仍然在继续,直到酶系的底物耗尽或 pH不再适合反应进行时才终止。这个过程中,酶的活动方向趋向于水解反应,各种成分都会发生变化。山蕗菜采收后,留在地里的根被水浸过以后,会很快腐烂,其速度比一般植物要快得多,这很可能是由于其自身的酶活力比较高,很容易水解自身物质并被微生物利用所致。本文研究山蕗菜根主要酶的活性,为山蕗菜根的开发及其酶的资源利用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料

山蕗菜根采自江西九江地区。经本实验室测定其蛋白质、多糖和纤维素含量分别为 12.3%、30.4%和 19.9%。

1.1.2 仪器和试剂

722型分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)、AR1140电子分析天平 (美国奥豪斯贸易公司)、Anke TDL-5-A低速大容量离心机 (上海安亭科学仪器厂)、BD-86L低温冰柜 (青岛海尔特种电冰柜有限公司)、KDY-9820凯氏定氮仪 (厦门精艺科技有限公司)、DZT W调温电热套 (北京市永光明医疗仪器厂)、SK3310HP超声清洗器 (上海科导超声仪器有限公司)、JYL-350A料理机 (九阳股份有限公司)、PHS-3C型 pH计 (上海精密科学仪器有限公司);无水硫酸铜、氢氧化钠、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、重铬酸钾、淀粉、硫代硫酸钠、碘化钾、醋酸、硝酸、福林试剂、DNS试剂、考马斯亮蓝 (以上试剂均为分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白质含量随时间的变化

把新鲜山蕗菜根匀浆,取 10支离心管,分别加入 2 g匀浆液,在 40℃水浴中分别放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h,立即放在沸水浴中灭酶 10 min,备用。用凯氏定氮仪测定各样品的蛋白质含量[3],每份做 3个平行。

1.2.2 多糖含量随时间的变化

取 10支干净试管,分别加入约 2.5 g匀浆液,在 40℃水浴中分别放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h,立即放在沸水浴灭酶10 min。转入圆底烧瓶,加 40 mL 80%乙醇 95℃回流 1 h,抽滤,滤渣用 40 mL水提取 2 h[4-5]。抽滤,滤液定容到 100 mL备用。用苯酚 -硫酸法[6]测定多糖含量,用葡萄糖标准溶液绘制标准曲线,得到标准方程:y=6.988 4x-0.011 3,其线性相关系数 R2=0.998 8。

1.2.3 纤维素含量随时间的变化

取 30支试管,分别加入 1.5 g匀浆液,均分成10组 ,每组在 40℃水浴中分别放置 0、0.5、1.0、1.5、2.16、2.83、3.5、4.5、5.5、7.0 h。按 72%硫酸水解法[7]测定纤维素含量。

1.2.4 酶的粗提及其浓度测定

取 250 g样品,加磷酸缓冲溶液 (pH值 6.5),捣碎匀浆 (M∶V=1∶1),4层纱布过滤,滤液加硫酸铵至 20%饱和度,加 EDTA和维生素 C各 0.05 g,4℃下过夜,离心去沉淀,上清液加硫酸铵至 85%饱和度,离心得沉淀[8]。取部分沉淀溶于适量水中,用考马斯亮蓝 G-250法[9]测定酶蛋白的含量。

1.2.5 蛋白酶总活力测定

参照福林法[10]测定蛋白酶活力。定义:在测定条件下 1 g粗蛋白 1 min内经酶分解酪蛋白产生1μg酪氨酸表示一个活力单位。计算公式如下:

式中:A1为试样吸光度;K1为标准曲线斜率;V1为酶水解时的总体积(mL);T1为水解时间 (min);C为根提取液中酶平均浓度μg/mL。

1.2.6 多糖酶总活力测定

用 DNS法[11-12]测定多糖酶活力。定义:在测定条件下 1 g粗多糖 1 min内经酶分解自身多糖产生 1μg葡萄糖为一个活力单位。计算公式如下:

式中:A2为试样吸光度;K2为标准曲线斜率;V2为酶水解时的总体积(mL);T2为水解时间 (min);C为根提取液中酶平均浓度μg/mL。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量变化

山蕗菜根经匀浆处理,放置不同时间其蛋白氮含量的变化情况见图1。从图中可以看出,前 0.5 h蛋白氮含量下降很快,相对含量减少 35%,1 h时减少了 41.58%,此后的 6 h蛋白氮含量下降很少。这表明蛋白酶在前 1 h内活性很高,尤其是前 0.5 h;在 0.5 h～1 h之间,酶活性降低速度较快,随着时间的延长其活性降至较低。

图1 蛋白质含量随时间的变化

2.2 多糖含量变化

山蕗菜根经匀浆处理,放置不同时间其多糖含量的变化情况见图2。从图中可以看出,多糖含量在前 2 h内变化比较平稳,下降较快,相对含量减少26%左右,之后下降很小,3 h左右基本达到稳定,此后多糖含量下降很少。这表明在前 2 h内多糖分解酶活性较稳定,活力也较大,之后活性降低,3 h后几乎没有活性。

图2 多糖含量随时间的变化

2.3 纤维素含量变化

山蕗菜根经匀浆处理,放置不同时间其纤维素含量的变化情况见图3。从图中可以看出,纤维素含量在前 3 h内变化比较平稳,下降较慢,此后纤维素含量变化较小,3.5 h后 (相对含量减少 3.8%左右)基本保持不变。这表明山蕗菜根中纤维素酶随时间的延长活性降低,而且与蛋白酶和多糖分解酶相比活性较低。因此,本文选择活性较高的蛋白酶和多糖酶为研究对象测定其活性。

图3 纤维素含量随时间的变化

综合图1、2、3,可知在相同的时间内,蛋白质含量的相对减少量大于多糖,多糖大于纤维素,说明山蕗菜根的蛋白质很容易被自身的酶作用,其次分别为多糖、纤维素。本文通过对蛋白质、多糖和纤维素的含量随时间的相对变化的研究可知,蛋白质水解程度为 50%左右,多糖约为 26%,纤维素约为3.8%,而且水解速度蛋白质大于多糖和纤维素,由此推出山蕗菜根蛋白酶活力高于多糖酶,纤维素酶的活性则较小。

2.4 酶提取液浓度测定

用牛血清蛋白溶液作标准曲线,得到其标准方程为 y=0.000 4x+0.000 3,线性相关系数 R2=0.994 1。将样液吸光度折算成酶蛋白浓度,结果见表1,山蕗菜根提取液中酶蛋白平均浓度 (C)为23.83μg/mL。

表1 酶提取液蛋白质含量

2.5 蛋白酶活性测定

用酪氨酸标准溶液绘制标准曲线,其方程为 y=111.00x-24.601,R2=0.999 9,斜率 K1=111.00。把测得的吸光度值 A1、酶水解时的总体积V1(4 mL),水解时间 T1(10 min),根提取液中酶平均浓度 C(23.83μg/mL),代入 (1)式计算蛋白酶活力,得到平均活力为 24 221.57U/g蛋白 (表2)。

表2 蛋白酶活力

2.6 多糖分解酶活性测定

用葡萄糖标准溶液绘制的标准曲线,标准方程为 y=1.135 9x+0.080 5,线性相关系数 R2=0.994 3,斜率 K2=1.135 9。把测得的吸光度值 A2、酶水解时的总体积 V2(5 mL),水解时间 T2(30 min),根提取液中酶平均浓度 C(23.83μg/mL)代入 (2)式计算的多糖酶活力见表3,得到多糖酶平均活力为45 018.65U/g蛋白。

表3 多糖酶活力

3 讨 论

本文通过研究山蕗菜根主要物质含量随时间的变化情况,侧面反映其中酶的活性。结果表明山蕗菜根的蛋白质很容易被自身的酶作用,其次分别为多糖,说明山蕗菜根蛋白酶活和多糖酶活性较高。据种植山蕗菜职工反映,山蕗菜收采后留在地里的根水泡后极易腐烂,这可能与其所含高活性的酶有关。经研究,山蕗菜根中蛋白质、多糖含量分别为12.3%、30.4%,高活性的蛋白酶和多糖酶在适宜的条件下 (温度和水泡)极易水解蛋白质和多糖。

本文用福林法和 DNS法[11-12]分别测得粗提液蛋白酶和多糖酶活力为 24 221.57 U/g粗蛋白和45 018.65 U/g粗蛋白。但其活性比一些酶制剂要低,方焕等[13]测得木瓜蛋白酶活力在 37℃为 31.2万 U/g干粉,在最适温度 80℃时为 54.6万 U/g干粉,分别为本蛋白酶的 15倍和 23倍。这可能与酶纯度有关,因为本实验使用的是粗酶液;此外酶作用的条件如温度、反应物浓度、pH、金属离子等对酶的活性也有较大影响;因此有必要开展山蕗菜根酶的分离纯化和酶作用条件的优化。

[1] 毋 冰.蜂斗菜 Petasites hybridus L.和旱芹 Apium graveolens L.的化学成分研究[D].沈阳药科大学硕士学位论文,2007.

[2] Xie W D,Zhang Q,Li Pi,et a1.Two triterpenoids and other constituents from Petasites tricholobus[J].Phytochemistry,2005,66:2340-2345.

[3] 侯曼玲.食品分析 [M].北京:化学工业出版社,2004:130-131.

[4] 杨惠麟.白毛藤多糖的提取及其药效学的初步研究[D].湖南农业大学,2006.

[5] 程 迪,于 洁,董 丽.河南产牡丹皮中多糖含量的测定[J].安徽农业科学,2008(2):518,528.

[6] 马猛华,崔 波,于海峰,等.苯酚一硫酸法测定玫瑰花渣中多糖含量的研究[J].山东轻工业学院报,2008,22(4):23-25.

[7] 熊素敏,左秀凤,朱永义.稻壳中纤维素、半纤维素和木质素的测定[J].粮食与饲料工业,2005(8):40-41.

[8] 顾昌玲,朱宝成,周艳芬,等.延胡索纤溶酶的分离纯化及部分性质[J].中国生化药物杂志,2008(2):81-84.

[9] 李 娟,张耀庭,曾 伟,等.应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量[J].中国生物制品学杂志,2000(2):118-120.

[10] 邹建云,林文光.直接测定菠萝皮汁蛋白酶活性的方法[J].云南热作科技,1998,21(3):38-39.

[11] 刘德海,杨玉华,张发旺,等.饲用纤维素酶活力测定方法的探讨[J].饲料工业,2002,23(4):34-35.

[12] 佟爱东,黎宇君.达吉胶囊中纤维素酶的活力测定[J].中国生化药物杂志,2005(5):299-301.

[13] 方 焕,生吉萍,吴显荣.工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较[J].食品与机械,2000(6):27-29.