龙血竭外用对糖尿病大鼠皮肤溃疡Smads蛋白表达的影响

贺选玲 ，肖 凡 ，王莘智 ，黄政德 *

（1.长沙市中医医院，湖南 长沙 410002；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

龙血竭外用对糖尿病大鼠皮肤溃疡Smads蛋白表达的影响

贺选玲1，肖 凡2，王莘智3，黄政德1*

（1.长沙市中医医院，湖南 长沙 410002；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 探讨龙血竭外用对糖尿病大鼠皮肤溃疡Smads（drosophila mothers against decapentaplegic protein）蛋白表达的影响。方法 建立糖尿病大鼠皮肤溃疡模型，以胰岛素为对照药，随机分为龙血竭组、胰岛素组、模型组、正常组。龙血竭组予以龙血竭胶囊内容物外用于创面，每天换药1次，连续用药14 d；胰岛素组予以胰岛素稀释液外用于创面，每天换药1次，连续用药14 d；模型组、正常组大鼠将创伤面暴露于外，不作任何处理。检测各组大鼠Smads蛋白表达水平。结果 模型组Smad3、Smad4的表达水平高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)；各用药组Smad3、Smad4的表达水平低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。龙血竭组Smad3、Smad4表达水平低于胰岛素组，差异有统计学意义(P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论 龙血竭对糖尿病大鼠皮肤溃疡Smads蛋白表达有下调作用。

龙血竭；糖尿病；皮肤溃疡；Smads蛋白；大鼠

糖尿病是一种全身慢性代谢性疾病，它可引起全身小动脉、微小血管硬化，造成局部血供不良引起组织缺氧缺血坏死，形成溃疡。糖尿病溃疡是糖尿病常见和严重的并发症，临床主要表现为局部溃疡、感染和坏疽，常给患者带来巨大的痛苦和沉重的经济负担。近年来，其发病率逐年上升，临床治疗难度大，影响因素多，效果欠佳，预后差。龙血竭是中医治疗溃疡的主药，《本草纲目》记载可用于金疮出血，破积血，止痛生肉，去五脏邪气。补虚益阳精，清一切恶疮疥癣。

湖南中医药大学第一附属医院在用龙血竭治疗糖尿病溃疡的前期临床研究[1]中，发现龙血竭外用是治疗糖尿病皮肤溃疡的一种有效药物，治疗组有效率为83.3%,优于对照组51.5%,且治疗组显效率达55.5%,明显优于对照组的24.2%。为探讨血竭治疗糖尿病皮肤溃疡的作用机制，根据资料显示龙血竭的可能作用机制，我们从与组织修复作用密切相关的Smads蛋白入手进行了龙血竭对糖尿病大鼠溃疡创面的实验研究。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 龙血竭胶囊（云南云河药业有限公司生产，国药准字 Z53020999，批号：090835，0.3g/粒）。

1.1.2 动物 清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量200～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（湘）：2009-0004。

1.1.3 试剂 免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法 (streptavidin-biotin peroxidase method，SP)试剂盒、Smad3一抗、Smad4一抗、HRP标记山羊抗兔二抗（美国Invitrogen公司）、DAB显色液（北京鼎国生物技术有限公司）、化学发光底物（美国Pierce公司）。

1.1.4 仪器 Sigma 3K18型低温冷冻离心机（美国Sigma公司）；电子分析天平Toledo（瑞士METTLER公司）；IMS细胞图像分析系统（上海申藤信息技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模[2-3]选取48只SD大鼠给予链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)30 mg/kg腹腔内1次快速注射，STZ临用前以无菌枸掾酸钠液配制成2%浓度的溶液，pH 4.5。糖尿病动物模型在诱导前和诱导后72 h均经尾静脉采血，用传统的氧化酶反应检测血糖水平。诱导后72 h血糖水平＞16.7 mmol/L时，即可视为糖尿病模型诱导成功。选取糖尿病造模成功的大鼠36只制作糖尿病皮肤溃疡模型，参照付小兵等[2]全层皮肤缺损法制成动物体表溃疡模型，将糖尿病大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔内注射麻醉后背部备皮，在脊椎两侧作直径15 mm的圆形标记，用外科方法切除标记处全层皮肤，止血后用无菌纱布覆盖，即成糖尿病溃疡模型。

1.2.2 动物分组及给药方法 将36只糖尿病皮肤溃疡模型大鼠随机分为龙血竭组、胰岛素组、模型组（糖尿病溃疡大鼠创面不用药），共3组，每组12只。正常创面组（正常大鼠创面不用药）12只（空白组）。龙血竭组予以龙血竭胶囊内容物外撒于创面，每天换药1次，连续用药14 d；胰岛素组予以胰岛素稀释液 (比例：生理盐水10 mL、胰岛素4 U）外用于创面，换药1次/d，连续用药14 d；模型组、正常组大鼠将创伤面暴露于外，不作任何处理。用药后第15天，分别将动物麻醉(水合氯醛)后处死，取局部创面组织为所需实验样品。

1.2.3 Smad3、Smad4mRNA蛋白表达的检测 取各组大鼠创面组织，生理盐水清洗后，4%多聚甲醛固定溶液固定。每组随机选取12个样本，将已固定的各肉芽组织标本分别常规脱水、浸蜡、包埋，连续切片；常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；阻断 灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS冲洗3×5 min；抗原修复：置 0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸（95 ℃，15～20 min），自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3×5 min。10%正常血清封闭内源性非特异性，室温30 min正常羊血清工作液封闭，37℃ 10 min，倾去勿洗.滴加一抗4℃ 冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗,37℃孵育30 min,PBS冲洗3×5 min;滴加HRP标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育 30 min，PBS 冲洗 3×5 min；DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。图像分析，IMS细胞图像分析系统，通过显微镜、图像采集卡、数码相机采集数字图像，数字图像为标准的BMP(位图)文件格式；在100倍显微镜下，先点击图像微尺上的两个点，再将它的实际微米数输入计算机，计算机自动计算得到比例因子后存储备用；消除免疫组化图像中的紫蓝色背景；选择阴性区域，处理后用蓝色表示；选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后用红色表示；测定图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值，以积分光密度值代表Samd3、Smad4的表达水平。1.3 统计学分析

2 结果

模型组Smad3、Smad4的表达水平高于正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)；各用药组 Smad3、Smad4的表达水平低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。龙血竭组smad3、smad4表达水平低于胰岛素组，差异有统计学意义 (P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 大鼠皮肤溃疡创面肉芽组织Smad3、Smad4mRNA 表达（±s）

表1 大鼠皮肤溃疡创面肉芽组织Smad3、Smad4mRNA 表达（±s）

注：与龙血竭组比较△P＜0.05；与胰岛素组比较▲P＜0.05；与模型组比较☆P＜0.05；与正常组比较★P＜0.05。

组 别龙血竭组胰岛素组模型组正常组n 12 11 10 12 Smad3 20 693.33±736.33▲☆25 651.38±1 213.07△☆★35 141.11±2 514.40△★19 132.89±730.57☆Smad4 48 748.79±952.54▲☆52 166.75±1 357.19△☆★60 608.33±1 013.71△★47 045.95±918.14☆

3 讨论

临床与实验研究发现 ，糖尿病溃疡多有“疮口下陷，久不收口，腐肉已脱，起白色厚边。脓液稀少，肉芽灰白或黯淡，疮周皮肤色暗黑，板滞木硬。或青筋显露。舌暗红或淡紫，或有瘀斑。苔白腻，脉细涩”等“虚”、“瘀”之象。“久病必虚”、“久病必瘀”、“虚可致瘀，瘀可致虚”，糖尿病溃疡创面久不愈合的主因在于气虚血瘀的存在，我们认为只有气血足、局部瘀滞祛除，才能断生腐之源，生肌长皮。故临床治疗常以“祛瘀生新”为指导，提出“祛瘀生肌”、“补虚生肌”理论。

血竭具有活血散瘀、止痛、止血、生肌敛疮的功效。龙血竭的生肌收敛作用在预防皮肤软组织损伤中作用显著，应用龙血竭后，患处肿胀消退迅速，未完全受损的组织快速恢复正常，受损局部血液循环迅速建立，促使创面组织软化，重建活力，促进愈合。《本草纲目》云：麒麟竭……此物干如血，故谓之血竭主治心腹卒痛，金疮出血，破积血，止痛生肉，去五脏邪气。补虚益阳精，清一切恶疮疥癣，散淤血渚痛……”并推崇血竭为“和血圣药”。有大量文献报道血竭可治疗糖尿病并发的溃疡。我院在前期临床观察中发现，龙血竭外用是治疗糖尿病足溃疡的一种有效药物，故对龙血竭进行进一步研究。

糖尿病皮肤溃疡创面修复愈合是一个连续的复杂过程，其中多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的网络作用是该过程中的关键因素之一[4]。Smads蛋白与TGF-β1在组织修复中的作用密切相关[5]，目前已被公认为“修复相关基因”，其中Smad3、Smad4与TGF-β的信号调控最为密切。Smad3可以调节创面愈合，且必须与Smad4形成复合物，才能迁移至细胞核中促进靶基因表达。Smad3、Smad4基因的失控可能是创面愈合延迟、不愈合或瘢痕过度增生的真正原因[6]。提示糖尿病创面组创面Smad3、Smad4的高表达可能是糖尿病创面愈合缓慢的原因之一。故本研究从龙血竭对糖尿病大鼠皮肤疡Smads蛋白表达的影响来探讨龙血竭治疗糖尿病皮肤溃疡的作用机制。本项研究结果显示龙血竭组smad3、smad4表达水平低于阳性对照组(P＜0.05)，与正常组无明显差异(P＞0.05)。由此我们推测下调smad3、smad4表达水平可能是龙血竭治疗糖尿病皮肤溃疡的作用机制。

[1]黄政德，王莘智，贺选玲，等.龙血竭胶囊治疗糖尿病足溃疡疗效观察[J].中国中医药信息杂志，2008，15（7）：72.

[2]付小兵，王德文.创伤修复基础[M].北京：人民军医出版社，1997：202-216.

[3]孙同柱，付小兵，赵志力，等.重组人血小板源性生长因子凝胶剂促进糖尿病大鼠创面愈合的实验研究[J].中国危重病急救医学，2003，15（10）：596-599.

[4]Akman H O，ZhangH，SiddiquiM A，etal.Response to hypoxia involves transforming growth factor-β2 and SMAD proteins in human endothelial[J].Blood，2001，98(12)：3324-3331.

[5]AshcrcftG S，Roberts A B.Loss ofSmad3 modulates wound healing[J].Cytokine Growth Factor Rev，2000，11(1)：125-131.

[6]邱艳飞，朱旭东，刘 琛，等.大鼠皮肤伤口愈合中转化生长因子β信号转导分子Smad3、Smad4的表达[J].中华创伤杂志，2002，18(7)：407-409.

Effects of dracaena on expression of Smads protein in skin ulcers in diabetic rats

HE Xuan-ling,WANG Shen-zhi,HUANG Zheng-de
(TCM Hospital of Changsha,Changsha,Hunan 410002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Dracaena on expression of Smads protein in skin ulcers in diabetic rats.MethodsThe models of the skin ulcers model in diabetic rats were induced and Insulin was used as the control drug,all the rats were randomly divided into the Dracaena group,Insulin group,modelgroup and normalgroup.In Dracaena group,the contents of Dracaena capsule was used outside the wound dressing,in Insulin group,the Insulin diluent used to the wound dressing,one time a day,continuous medication 14 days in both groups;in the normal and model groups,the wounded surface was exposed to the air and without any treatment.Then,the protein levels of Smads were detected.ResultsThe expression levels of Smad3 and Smad4 in model group were higher than those in the normal group(P＜0.05);the expression levels of Smad3 and Smad4 in treatment group lower than those in model group(P＜0.05).the expression levels of Smad3 and Smad4 in Dracaena group lower than those in In-sulin group(P＜0.05),but compared with normal group,the difference was not statistically significant(P＞0.05).Conclusions Dracaena is effective to reduce Smads protein expression in skin ulcers in diabetic rats.

Dracaena；diabetic；skin ulcers；Smads protein；rats

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.007.023.03

2010-03-12

湖南省科学技术厅科技计划资助项目（2009SK3122）。

贺选玲（1980-），女，湖南双峰人，博士，主要从事中医内科病研究工作。

* 黄政德，男，教授，博士研究生导师，E-mail：HZD112＠163.com。

（本文编辑 彭芝配）