雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫对血清中抗氧化物酶产生的影响

郭 兵,王海凤,庞春酉,孙秀梅,许 丽,刘荣欣

(1.河北北方学院动物科技学院,张家口075000;2.河北农业大学定州中兽医学院,定州0730003)

自1870年艾美耳发现鸡球虫以来,鸡球虫的危害逐渐被世界各国所重视.目前,集约化养鸡场成为球虫病爆发的最适宜场所,其发病率达50%～70%,死亡率达20%～30%,严重时高达80%.在各种鸡病中,球虫病的发生率最高,占1/6～1/5[1].而且,由于鸡球虫病造成的鸡群生长滞缓,产蛋量下降,往往比鸡死亡带来的经济损失更大[2],严重威胁着养鸡业的发展.近几十年,分子生物学、免疫学及其相关技术在寄生虫疾病研究中不断应用,使球虫病的研究在生活史、遗传学、超微结构、生理生化、体外培养、耐药性、生态学、流行病学、诊断、免疫和防治等方面均取得了大量成果.

自由基 (Free radicals,FR)是指具有不配对电子的原子或原子团、分子或离子[3],自由基与人和动物的发病机理密切相关.在疾病情况下,机体通过酶系统和非酶系统产生的氧自由基是体内最为活泼,危害最大的一种自由基.它能使生物膜中的多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fatly acid.PUFA)引发脂质过氧化作用,并因此形成脂质过氧化物,如丙二醛 (MDA)、羟基、氢过氧基或内过氧基[4].自由基的清除依靠机体内各种抗氧化酶,这些酶不但协同地防止氧自由基的损伤效应,而且相互间还起着保护作用.超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CA T)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)是细胞内的主要抗氧化酶,血液中SOD,GSH-Px,CA T活力高低间接反映了机体清除自由基的能力.SOD是催化超氧阴离子自由基岐化反应的一类酶,能催化反应活性强、具有潜在毒性的超氧阴离子自由基O2-和 H2O2[5].而H2O2又由GSH-PX催化分解[6],GSH-PX是一种含硒抗氧化酶,主要分解脂质过氧化物和H2O2保护细胞免受氧化损伤,可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[7].二者对清除自由基的毒性作用极为重要.

MDA是机体内氧自由基代谢中产生的脂质过氧化物 (LPO),它能使酶分子中氨基酸发生交联、肤链断裂,形成新的聚合物,从而产生新的大分子,使原来酶活性更新丧失或改变,破坏细胞的膜结构,使膜内外离子交换紊乱,加速自由基的产生[8].细胞内MDA的浓度是脂质过氧化强度和膜系统伤害程度的重要指标.它们可以反映机体LPO生成速率和强度,也间接反映组织LPO损伤程度.MDA测定和SOD、CA T、GSH-Px测定的联合应用,既反映了机体清除氧自由基的能力,又间接反映了机体细胞受FR攻击的严重程度[9].本试验通过对SOD、CA T、GSH-Px活性与MDA含量的测定,从亚细胞水平上分析自由基类分子在球虫感染过程中的作用,探讨氧化损伤与球虫感染的关系,为进一步防治鸡柔嫩艾美耳球虫病提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1日龄罗曼蛋公雏购自下花园孵化场,饲喂不含抗球虫药的雏鸡饲料,14日龄粪便镜检确认无球虫卵囊后作为试验用鸡.

丙二醛、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷光甘肽过氧化物酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所,所用主要仪器为722E型可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司.

鸡E.tenella孢子化卵囊购自中国兽医药品监察所.

1.2 方法

试验前以1.2×105个卵囊/只的剂量感染雏鸡,感染后第8 d扑杀,刮取盲肠内容物,采用饱和盐水漂浮法分离,计数8.0×104个/mL供试验用.

选择体重相近的14日龄蛋公雏80只,随机分成2组：健康对照组和试验组,每组40只.用钝头注射器将0.4 mL含有8.0×104个鸡E.tenella孢子化卵囊悬液接种到鸡的素囊中,至第12 d结束.

感染后逐日观察并记录各组的精神、食欲、粪便变化及死亡情况,在试验的第0 d,3 d,6 d,9 d,12 d每组随机抽取5只,心脏采血并分离血清,-20℃下保存,用于血液生化指标测定.

1.3 测定项目及方法

分光光度计检测血清中SOD、GSH-Px、CA T活性和MDA的含量,按试剂盒说明书用黄嘌呤氧化酶法检测 SOD活性,二硫代二硝基苯甲酸法检测 GSH-Px活性可见光法测定CA T活性 ,硫代巴比妥酸法(TBARs)检测MDA含量.方法及步骤严格按照试剂盒说明书进行.

2 统计处理

使用Excel 2003和SPASS 11.5软件包,以单变量方差分析 (one-way ANOVA)进行统计,数据以均值±标准差S)表示,P＞0.05为差异不显著,P＜0.05为差异显著,P＜0.01为差异极显著.

3 结 果

雏鸡感染E.tenella后,对照组血清中SOD活性缓慢升高,试验组SOD活性均低于对照组.SOD活性在第3、6、9 d时明显降低,极显著低于健康组 (P＜0.01);感染球虫6 d时对照组血清中GSH-PX活性显著高于试验组 (P＜0.05).其它时间各组血清中 GSH-PX活性差异不显著 (P＞0.05).从整个试验过程来看,对照组血清中 GSH-PX活性趋于稳定.3 d时各组变化趋势一致,6 d时试验组血清中 GSH-PX活性明显下降,9 d时回升至正常水平,12 d时趋于稳定;血清中CA T活性及血清MDA含量与健康组比较无明显变化 (P＞0.05).

表1 各种抗氧化物酶的测定结果

4 分析讨论

目前,自由基已成为生物学研究一个十分活跃的领域.迄今为止,几乎所有的生命现象和病理过程,诸如老化与衰老、体克、炎症、免疫性疾病、应激、以及癌症等,都有学者从自由基角度进行研究.在生物学和医学领域内,许多学者对自由基医学进行了广泛而深入的研究,拓宽了人们的视野,使人们对于许多疾病的病因、发病机制和病理生理过程有了全新的认识,并为一些疾病的治疗提供了新的依据.

动物在正常的生理条件下机体内自由基的产生、利用和清除保持着动态平衡,自由基的清除依靠机体内各种抗氧化酶,包括SOD、CA T和 GSH-PX等,这些酶不但协同地防止氧自由基的损伤效应,而且相互间还起着保护作用.近年来研究表明,动物体内许多疾病与自由基对机体的损伤有关.如癌症和衰老的发病机理与脂质过氧化有关.脂质过氧化产物褐色素沉着于皮肤会出现老年斑,沉着于心、肾、脑等脏器会影响它们的结构、形态和功能.矿物质和维生素代谢紊乱时氧损伤有时也会加重,如支气管哮喘就是因为锌和维生素严重缺乏,结果GSH-Px,SOD和CA T的活性降低,MDA水平升高[10].当机体内维生素E,维生素C,维生素A等缺乏时,也会出现氧应激反应[11].糖尿病的发病机理与自由基代谢紊乱有一定关系,肝炎、肝硬化患者自由基的水平明显升高[12],另外,像烧伤、休克等引起的缺血再灌是自由基产生的温床[13],锥虫病、奶牛产后应激、动物缺硒病等都与自由基有密切关系[14,15].

本试验结果表明,雏鸡感染E.tenella后,血清中SOD活性在第3、6、9 d时明显降低,极显著低于健康组,血清中 GSH-Px活性在第6 d时明显降低,显著低于健康组,血清中CA T活性及血清MDA含量与健康组比较无明显变化.表明鸡球虫病在发病过程中,细胞内脂质过氧化反应增强和抗氧化能力下降,以致氧自由基反应性增强,从而加剧细胞损伤,可见氧自由基在鸡球虫病发病过程中起重要作用.

自由基不仅破坏细胞的膜结构,同时也攻击DNA,使其断裂、重排、交联、成为致炎、致瘤作用的重要环节之一,也可加速正常的细胞凋亡.本实验中,患鸡的SOD、GSH-Px、CA T活性和MDA含量测定表明,E.tenella感染过程中,随着机体组织器官的损伤,血清中SOD、GSH-Px活性降低,自由基代谢出现严重紊乱,抗氧化系统处于低能状态,使氧自由基的清除发生障碍,导致大量氧自由基积聚;当体内氧自由基积累超过了机体抗氧化的能力时,氧自由基首先攻击生物膜的不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此生成脂质过氧化物的终产物MDA.脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂,而且通过链式或支链反应,不断产生新的自由基,放大活性氧的作用,引起细胞的损伤,细胞代谢及功能障碍,最终导致鸡体组织病理损伤,引起鸡体发病.本文的研究表明在抵抗球虫感染所造成的损伤过程中,提高体内抗氧化酶活性是可能的途径之一.

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