千层塔NFT扦插育苗技术研究

覃大吉，杨永康，向极钎，曾凡忠，李亚杰，殷红清，邹迎春，马 进

(1. 湖北省农业科技创新中心鄂西综合试验站,湖北 恩施 445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

千层塔(Huperziaserrata(Thunb.) Trev.)为石杉科植物蛇足石杉[1]，千层塔全草入药，民间主治痈疖肿毒，跌打损伤[2].1972年国内首次报道该植物的生物碱石杉碱甲(HuPerzine A.)在动物试验上有横纹肌松弛作用[3]，随后又发现石杉碱甲对老年性痴呆、重症肌无力和记忆力减退等疾病具有良好的治疗效果[4,5].

千层塔植株顶端具有生殖芽，落地可生根成新苗.长有孢子囊，成肾形，淡黄色，横生叶腋，成熟时撒出孢子粉[6].主要分布在东北、长江流域以南等地区的山区林下阴湿处，野生条件下通过孢子和生殖芽繁殖，但鉴于孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6～15年才能成熟[7].虽然我国蛇足石杉资源分布区域广阔且生物量较大，但分布星散，资源更新周期较长，可供开采的天然资源可能比估计的开采量还要小，因此，直接采收天然资源是不太可行的利用途径，而要从根本上解决蛇足石杉资源短缺问题，则有必要寻求比较科学合理的开发利用方式[8].有些学者认为孢子人工繁殖和生物技术离体繁殖方法是解决石杉碱甲药源稀缺问题的较好的途径[9].野外观察发现，千层塔通过生殖芽繁殖的现象也极少，因此极大地限制了千层塔野生资源的再生.野生资源也不能满足市场需求，有必要寻找一条快速大量繁殖千层塔的途径.本试验试图通过对千层塔扦插的研究，找到一条能提前千层塔插条生根，并提高生根率的繁殖途径，在不影响人工栽培千层塔药材产量的同时达到大量快速繁殖千层塔种苗的目的.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验植物材料 野生千层塔资源的种兜、茎段、茎梢、枝条若干.

1.1.2 试验其它材料 自制植物无土栽培NFT(nutrient film techniquey)育苗床(储液池：10L)三台(套)、84消毒液、MS大量元素母液、MS微量元素母液、EDTA-铁盐，IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚乙酸)、2，4-D(2-，4-二氯苯氧乙酸)等.

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 采用随机区组法设置试验处理，重复3次，共68个处理(含4个对照)，每个处理100个样本.处理编码如下：

营养配方:Y1(1/8MS),Y2(1/4MS)

激素种类:J1(IAA),J2(NAA),J3(IBA),J4(2，4-D)

激素处理浓度(mg/L):C1(1 000 mg/L浓度激素浸泡20 min),C2(500 mg/L浓度激素浸泡20 min)

外植体:Z1(种兜)，Z2(茎段)，Z3(茎梢)，Z4(枝条)

处理编码：Y1J1C1Z1，Y1J1C1Z2，Y1J1C1Z3，Y1J1C1Z4；Y1J1C2Z1，Y1J1C2Z2，Y1J1C2Z3，Y1J1C2Z4；

Y1J2C1Z1，Y1J2C1Z2，Y1J2C1Z3，Y1J2C1Z4；Y1J2C2Z1，Y1J2C2Z2，Y1J2C2Z3，Y1J2C2Z4；

Y1J3C1Z1，Y1J3C1Z2，Y1J3C1Z3，Y1J3C1Z4；Y1J3C2Z1，Y1J3C2Z2，Y1J3C2Z3，Y1J3C2Z4；

Y1J4C1Z1，Y1J4C1Z2，Y1J4C1Z3，Y1J4C1Z4；Y1J4C2Z1，Y1J4C2Z2，Y1J4C2Z3，Y1J4C2Z4；

Y2J1C1Z1，Y2J1C1Z2，Y2J1C1Z3，Y2J1C1Z4；Y2J1C2Z1，Y2J1C2Z2，Y2J1C2Z3，Y2J1C2Z4；

Y2J2C1Z1，Y2J2C1Z2，Y2J2C1Z3，Y2J2C1Z4；Y2J2C2Z1，Y2J2C2Z2，Y2J2C2Z3，Y2J2C2Z4；

Y2J3C1Z1，Y2J3C1Z2，Y2J3C1Z3，Y2J3C1Z4；Y2J3C2Z1，Y2J3C2Z2，Y2J3C2Z3，Y2J3C2Z4；

Y2J4C1Z1，Y2J4C1Z2，Y2J4C1Z3，Y2J4C1Z4；Y2J4C2Z1，Y2J4C2Z2，Y2J4C2Z3，Y2J4C2Z4；

对照编码：Y0J0C0Z1，Y0J0C0Z2，Y0J0C0Z3，Y0J0C0Z4(营养元素、激素浓度均为零处理)

1.2.2 试验实施

1.2.2.1 营养液配制 在植物组织培养室储存的MS培养基母液(1 000∶1)中直接用移液管加入2.5 mL大量元素和2.5 mL微量元素配制成供1个NFT育苗床(储液池：10 L)使用的1/4MS营养液，临时配制并添加相应浓度的铁盐；量取1.25 mL大量元素和1.25 mL微量元素配制成供1个NFT育苗床(储液池：10 L)使用的1/8MS营养液，临时配制并添加相应浓度的铁盐.

1.2.2.2 激素配制 激素为IAA、NAA、IBA、2，4-D.配制时分别用95%的乙醇溶解后再用蒸馏水稀释成1 000 mg/L(C1)和500 mg/L(C2)的浓度备用.

1.2.2.3 植物样本处理 首先用自来水清洗植物样本，凉干.操作人员清洗双手，消毒，然后剪取均匀一致的茎段、茎梢和枝条各1 700个，分别扎成小捆(100个/捆)，选留种兜1 700个，以每100个为1组.将茎段、茎梢、枝条各8捆和8组种兜按C1的方法进行处理，将另外茎段、茎梢、枝条各8捆和8组种兜按C2的方法进行处理.将茎段、茎梢、枝条各1捆和1组种兜采用对照处理方式处理相同的时间并凉干.

1.2.2.4 NFT育苗床制作与移栽 NFT育苗床制作：长6.0 m，宽1.25 m，高0.5 m，床体用高1.2 m的床架支撑.育苗床一端中间的底部为进液口，与储液池(长×宽×高=1.0 dm×2.0 dm×5.0 dm)的潜水泵(15.0 W)相连，育苗床另一端中间的底部为出液口，与储液池相连，进液口端底部比出液口端底部高6.0 cm，以便于营养液自动回流至储液池.育苗床内部底面铺设园艺无纺布，无纺布上面垫一层50目的塑料过滤网，过滤网内填充厚度为40 cm的珍珠岩，珍珠岩中按一定密度镶嵌着从定植板放下来的网格式定植杯(D上=1.8 cm，D下=1.2 cm,H=5.0 cm).床面放置厚度为2 cm的泡沫定植板，定植板上打有一定密度(2 cm×2 cm/孔、2 cm×4 cm/孔、4 cm×4 cm/孔、4 cm×5 cm/孔和5 cm×5 cm/孔)的定植孔，每个定植孔之内安放一个定植杯.

育苗床消毒及清洗：移栽定植前用200 mg/L浓度的84消毒液对无纺布、珍珠岩和育苗床的内面进行循环消毒30 min，然后用自来水进行全面清洗10 min.同时用75%乙醇对试验所需器具和育苗床的外面进行全面消毒.

移栽密度与排列：采用4 cm×5 cm/孔(株)的移栽密度，即500株/m2，在各处理样本之间和育苗床的进液口端和育苗床的出液口端用空定植杯(15排)进行空间隔离标示，同时填补没有移载处理样本的空余定植孔.移栽时，每个定植杯移栽1株处理后的植物样本.定植板上的排列为：空定植杯(横：25杯，纵：2排)-种兜(横：25杯，纵：32排)-空定植杯(横：25杯，纵：2排)-茎段(横：25杯，纵：32排)-空定植杯(横：25杯，纵：2排)-茎梢(横：25杯，纵：32排)-空定植杯(横：25杯，纵：1排)-枝条(25杯，纵：32排)-空定植杯(横：25杯，纵：2排).

移栽与定植：移栽前操作人员清洗双手，消毒.用珍珠岩作基质将样本固定在定植杯中间，将各处理样本及空定植杯按设计的排列方式依次进行移栽.移栽完成后，按营养液配制方法分别配制1/4MS和1/8MS营养液各10 L，同时配制对照组营养液(零浓度)10 L，分别注入相应的营养池中，调节pH值为5.6，开启电源，使NFT循环系统开始工作.

1.2.3 试验管理 试验进行中，随时注意营养液是否正常循环供给，每两天对pH值进行一次检测和调节，使之维持在pH5.6.每周更换一次营养液，以保证植株正常生根、发芽和生长的需要.试验在人工遮阳棚内进行，应保持育苗床不被阳光直射，以防烧苗，必要时可以用双层遮阳网.

2 结果与分析

各种外殖体经过不同种类及浓度的激素处理(浸泡30 min)后，在NFT循环营养(1/8-1/4MS营养液)供给培养下，培养98 d后，调查其生根、新叶发生情况，如表1，2所示.

表1 茎梢、枝条各培养阶段生根情况汇总表

注:1、Ⅰ为培养58 d观察值,Ⅱ为培养98 d观察值；2、种兜与茎段生根情况较差，没有列入此表；3、2，4-D处理效果较差，没有列入此表.

表2 茎梢、枝条各培养阶段新叶发生发生汇总表

注:1、Ⅰ为培养58 d观察值,Ⅱ为培养98天观察值；2、种兜与茎段新叶发生情况较差，没有列入此表；3、2，4-D处理效果较差，没有列入此表.

第Ⅰ培养阶段调查数据显示：在1/8MS营养液培养床，茎梢的平均生根率为56.67%,平均新叶发生率为74.83%;枝条平均生根率为62.17%,平均新叶发生率为83.83%.在1/4MS营养液培养床，茎梢的平均生根率为60.33%,平均新叶发生率为78.67%;枝条的平均生根率为59.17%,平均新叶发生率为82.5%.

第Ⅱ培养阶段调查数据显示：在1/8MS营养液培养床，茎梢的平均生根率为88.33%,平均新叶发生率为88.33%;枝条平均生根率为92.17%,平均新叶发生率为91.00%；在1/4MS营养液培养床，茎梢的平均生根率为87.00%,平均新叶发生率为87.00%;枝条的平均生根率为94.17%,平均新叶发生率为88.33%.

本研究筛选出平均生根率、新叶发生率较高的外殖体Z3和Z4，以及相应的激素处理种类(J1、J2和J3)，并从中筛选出平均生根率最高且新叶发生率也较高的两个处理，即Y1J3C1Z3(生根率：98%；新叶发生率：98%)、Y1J3C1Z4(生根率：98%；新叶发生率：93%).选择茎梢作外植体对药材收获产量影响较小，比选择枝条作外植体具有更大的优势.本研究形成了千层塔NFT扦插育苗技术体系:茎梢+IBA 1 000 mg/L 30 min浸泡+1/8MS无机营养液+98 d NFT培养.收获药材时剪切所有的茎梢作外植体进行育苗，人工栽培药材产量和种苗外植体材料都得到保证.

3 讨论

3.1 扦插繁殖外殖体选择

本试验选择种兜、茎段、茎梢、枝条作为外殖体进行生根与新叶发生情况研究，在不同激素种类及浓度处理后，在无营养液(CK)、1/8MS和1/4MS的NFT循环系统中通过两个培养阶段(Ⅰ：移栽-58 d培养，Ⅱ：58～98 d培养)后，调查并取得相关试验数据.通过对试验数据的平均数进行简单分析发现：茎梢与枝条具有明显的生根与新叶发生优势(2，4-D处理的除外).因此，选择茎梢与枝条作为千层塔扦插繁殖外殖体是理想的选择.

3.2 激素种类及处理浓度

从表1，2分析得知：在1/8～1/4MS培养条件下，各种激素以500～1000 mg/L浓度浸泡30 min处理，经过两个培养阶段(Ⅰ：移栽-58 d培养，Ⅱ：58～98 d培养)后，调查并取得相关试验数据，通过对试验数据的平均数进行简单分析发现：2，4-D处理的生根率与新叶发生率最低，且明显低于对照处理，说明2，4-D有抑制千层塔生根与新叶发生的作用.生根率较高的处理为IBA500-1000 mg/L浓度浸泡30 min处理，其中IBA1 000 mg/L处理茎梢生根率和新叶发生率均达到98%(1/8MS培养条件下)，枝条生根率达到98%，新叶发生率达到93%.因此，1 000 mg/L浓度浸泡30 min是较理想的激素处理方案.

3.3 营养液浓度

由于千层塔生长缓慢，所需营养元素的量不大，尤其是在外殖体生根和新叶发生期对营养物质的需求不明显，试验数据说明：从0～1/4MS范围内，营养液浓度对外殖体的生根率和新叶发生率的影响没有显著的区别.采用1/8MS浓度可以保证其最低的需求.

3.4 NFT扦插育苗方式

NFT扦插育苗方式：用无纺布衬底，用50目的塑料过滤网包裹珍珠岩(40 cm)作保湿透气蔽光支撑，不仅保证了外殖体生根部位保持在黑暗状态，同时保持了生根所需的湿度和通气度，采用循环流动的方式保证营养液持续供给同时又可以随时调节(浓度或pH值等)，是一种较理想的千层塔扦插育苗方式.只是育苗过程中必须保持60%～80%的遮阳度，以保证千层塔对环境光照强度的要求.

3.5 试验数据准确性

虽然有关处理的生根及新叶发生情况较好，但本研究仅调查了千层塔生根与新叶发生与否，对生根量的多少、生根分枝情况、新叶发生的多少以及新茎生长量等没有作具体测量，有待于作进一步系统研究.同时，针对不同类型的外殖体，自制的NFT扦插育苗床还可以作进一步功能性改善，以适应大规模人工育苗.

[1]江苏新医学院.中药大辞典(上册)[M].上海：上海科学技术出版社,1985:215.

[2]浙江省药用植物志编写组.浙江药用植物志[M].杭州:浙江科学技术出版社,1980:51-51.

[3]衰珊琴,冯锐,顾国明.蛇足石杉生物碱成分的研究(Ⅱ)[J].中草药,1994,25(9):453-454,473,502.

[4]余红英,孙远明,杨跃进.草药蛇足石杉的研究进展[J].中草药,2001,32(3):279-252.

[5]余红英,孙远明,杨跃生.蛇足石杉生物碱的研究[J].时珍国医国药,2002,13(3):176-179.

[6]江苏新医学院中药大辞典[M].上海:上海科技出版社，1985:215-216.

[7]中山大学生物系.南京大学生物系合编植物学[M].北京:人民教育出版社,1979:137.

[8]吴荭,庄平,冯正波,等.中国蛇足石杉资源调查与评估[J].自然资源学报,2005,20(1):59-66.

[9]黎万奎.蛇足石杉内生真菌生成石杉碱甲生物技术的研究[M].上海:上海中医药大学出版社,2006.