多壁碳纳米管固相萃取－高效液相色谱－串联质谱法测定食品接触材料中双酚－二环氧甘油醚的迁移量

吴新华， 丁 利， 李忠海， 张彦丽， 刘晓霞， 王利兵＊

（1.湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南出入境检验检疫局技术中心，食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南长沙410004；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004）

近年来，食品罐头、婴儿奶瓶、微波炉饭盒及其他许多食品接触材料中都用到了双酚A二缩水甘油醚（BADGE）、双酚F二缩水甘油醚（BFDGE）等环氧树脂作为内涂层［1］。其中BADGE和BFDGE会在食品接触材料的加工和储藏过程中向内容物迁移，造成污染，并形成水合物、氯代物等衍生物［2－4］。有研究报道，微量甚至痕量的双酚A及其环氧化合物即可能对动物生理活动、生殖系统以及胎儿发育造成不良影响［5］。鉴于其存在多种食品安全隐患，内涂料中双酚二缩水甘油醚及其衍生物迁移量的分析方法是各国食品安全检测的研究热点。

多壁碳纳米管（MWCNTs）是一种新兴的以碳为基础的纳米材料，具有一系列新异的物理化学特性。由于MWCNTs较大的比表面积及其特有的疏水性和结构，应用MWCNTs为基质进行固相萃取（SPE）受到越来越多的关注［6，7］。

目前对双酚－二环氧甘油醚迁移量检测的方法主要为高效液相色谱法（HPLC）［8，9］、液相色谱－质谱联用法（LC－MS）［10］、气相色谱－质谱联用法（GCMS）［11］、液相色谱－串联质谱联用法（LC－MS／MS）［12］等。本文采用MWCNTs为SPE柱填料，采用HPLC－MS／MS分析食品接触材料中的双酚－二环氧甘油醚向内容物的迁移量。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

API 4000三重四极杆质谱仪（美国ABI公司）配有岛津公司的高效液相色谱仪；SPE装置（美国Supelco公司）；高速离心机（德国Sigma公司）；多功能微量化样品处理仪（湖南长沙中讯电子工程研究所）。

叔丁基甲醚（MTBE）、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯（德国Merck公司）；乙酸铵为色谱纯（北京化工厂）；水为超纯水。

MWCNTs（直径20～30 nm，长度5～10μm，广东深圳纳米港公司）；双酚－二环氧甘油醚标准品：BADGE、双酚A（2，3－二羟丙基）甘油醚（BADGE· H2O）、双酚A（3－氯－2－羟丙基）甘油醚（BADGE· HCl）、双酚A（3－氯－2－羟丙基）（2，3－二羟丙基）醚（BADGE·H2O·HCl）、BFDGE、双酚F双（3－氯－2－羟丙基）甘油醚（BFDGE·2HCl）纯度均≥95%（美国Sigma公司）；藠头罐头、莲子罐头、鱼肉和牛肉罐头购自本地超市。

1.2 混合标准溶液的配制

分别准确称取标准品各10.0 mg，用甲醇定容至10 mL，配成1.0 g／L的标准储备溶液，4℃避光保存。取上述标准储备液，用甲醇配成100 mg／L的中间标准溶液，4℃冷藏避光储存。取适量储备液，用甲醇定容配1.0 mg／L的标准工作液。现用现配。

1.3 MWCNTs SPE柱的制备

除去商品化的SPE小柱中的填充物，彻底清洗小柱和聚乙烯垫圈。干燥小柱和垫圈后，用垫圈封住小柱的底部，称取0.25 g MWCNTs于SPE柱中，然后用垫圈封住小柱顶部，压紧MWCNTs，使其高度大约为1.8 cm。使用前先用5 mL甲醇、5 mL水进行活化。

1.4 样品前处理

1.4.1 提取

称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入15 mL MTBE，旋涡振荡1 min，超声提取20 min后，以7 500 r／min离心5 min，分离上清液。下层残渣再用5 mL MTBE采用上述步骤重复提取一次，合并两次提取液。将提取液置于多功能微量化样品处理仪上40℃吹至近干，用5 mL甲醇－水（50∶50，v／v）溶解，脂肪含量较高的食品需再加2 mL正己烷，混匀后弃去正己烷层，待净化。

1.4.2 净化

将上述提取液加载到活化后的MWCNTs SPE小柱上，控制流速为1 mL／min，弃去流出液，再用5 mL水淋洗，弃去淋洗液。最后用5 mL甲醇－乙酸乙酯（60∶40，v／v）洗脱，收集合并全部洗脱液，于多功能微量化样品处理仪上40℃吹至近干，用甲醇－水（50∶50，v／v）定容至1 mL，过0.45μm滤膜，供HPLC－MS／MS分析。

1.5 色谱条件

色谱柱为COSMOSIL C18柱（150 mm×2 mm，2.5μm）；柱温为30℃。流动相A为甲醇，B为含有0.1%甲酸的5 mmol／L醋酸铵溶液。梯度洗脱程序：0～10 min，40%B～5%B；10～15 min，5%B；15～16 min，5%B～40%B；16～20 min，40%B。流速为0.25 mL／min。进样量为10μL。

1.6 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子扫描；雾化气压力为413 kPa；辅助气压力为448 kPa；离子喷雾电压为5 500.00 V；气帘气压力为137 kPa；离子化温度为500℃；检测方式为多反应监测扫描（MRM）模式。6种双酚－二环氧甘油醚定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。

表1 多反应监测扫描模式下检测6种双酚－二环氧甘油醚的部分质谱参数Table 1 MS parameters for multiple reaction monitoring detection of 6 exogenous endocrine disruptors

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

利用流动注射泵连续进样，将每种质量浓度为100μg／L的双酚－二环氧甘油醚标准溶液分别注入离子源中，在正离子模式下进行母离子全扫描以选择适当的分子离子峰。结果表明，ESI＋电离模式下，目标化合物全扫描的准分子离子［M＋NH4］＋最理想。对该准分子离子峰进行二级质谱扫描（子离子扫描），得到离子碎片信息，获得二级质谱图。然后对去簇电压、碰撞气能量等参数进行了优化，使分子离子和特征碎片离子对强度达到最佳。在优化的质谱条件下，目标物的总离子流MRM色谱图见图1。由图1可见，6种分析物离子选择性好，峰形尖锐对称。

图1 6种双酚－二环氧甘油醚混合标准溶液（5μg／L）的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 6 bisphenol diglycidyl ethers（5μg／L）Peaks：1.BADGE·H2O；2.BFDGE；3.BADGE·H2O·HCl；4.BFDGE·2HCl；5.BADGE；6.BADGE·HCl.

2.2 提取溶剂的选择

在实验过程中，提取溶剂的选择是关键。本实验分别比较了甲醇、乙腈、MTBE和乙酸乙酯作为提取溶剂对双酚－二环氧甘油醚提取效率的影响，用上述溶剂超声提取罐头食品中的双酚－二环氧甘油醚的回收率见图2所示。由图2可以看出，用MTBE作为提取溶剂，6种双酚－二环氧甘油醚的回收率最好，因此本实验采用MTBE作为提取溶剂。同时比较了超声作用时间的影响，当超声作用15 min时，双酚－二环氧甘油醚能充分提取。

图2 不同溶剂提取罐头食品样品中双酚－二环氧甘油醚的回收率Fig.2 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in canned foodstuffs by different extraction solvents

2.3 MWCNTs用量的选择

实验发现MWCNTs的用量对实验有一定影响，用量过少则不能完全吸附目标物，用量过多则会影响上样时的流速。实验中制备不同填充质量的MWCNTs SPE小柱，MWCNTs用量从150 mg到 400 mg。称取几份空白样品各2.0 g并添加20 ng／g的标准溶液按1.4.1节所述步骤进行前处理，分别上样到上述SPE小柱，流速控制在1.0 mL／min，以6 mL甲醇－乙酸乙酯（50∶50，v／v）洗脱，回收率情况见图3。由图3可知，250 mg MWCNTs已能完全吸附6种目标物，用量过多不但回收率没有增加，反而会影响上样速率及洗脱效率。综合考虑，选定最佳的MWCNTs用量为250 mg。

图3 MWCNTs用量对回收率的影响Fig.3 Effect of MWCNTs dosage on recoveries

2.4 洗脱溶剂及其体积的优化

当添加20 ng／g待净化提取液到活化的MWCNTs SPE小柱后，分别比较了甲醇、乙腈和乙酸乙酯洗脱效率，洗脱溶剂体积为6 mL，流速控制在1.0 mL／min。实验结果表明：用甲醇洗脱时，BFDGE和BFDGE·2HCl的回收率不是很好，其余4种目标物都能达到80%以上；乙腈洗脱时的回收率不如甲醇好；乙酸乙酯洗脱时BFDGE和BFDGE ·2HCl的回收率能达到80%以上，但是其余4种均比较低，因此采用单一的溶剂无法从MWCNTs柱上把目标物全部洗脱下来。综合比较3种溶剂的洗脱效率，甲醇和乙酸乙酯的洗脱能力刚好互补，因此采用甲醇和乙酸乙酯混合溶液作为洗脱溶剂。考察了采用不同体积比的甲醇和乙酸乙酯洗脱时对回收率的影响，结果（见图4）表明甲醇和乙酸乙酯的体积比为60∶40时，各化合物的回收率最好。

图4 甲醇比例对回收率的影响Fig.4 Effect of methanol volume proportion on recoveries

考察不同体积下洗脱液对回收率的影响，洗脱溶剂为甲醇－乙酸乙酯（60∶40，v／v），流速控制在1.0 mL／min，不同洗脱溶剂体积对回收率的影响见图5。可以看出，随着洗脱体积的增大，双酚－二环氧甘油醚的回收率虽然也不断增大，但当洗脱液体积大于5 mL时，回收率的增长缓慢。综合考虑溶剂体积和回收率，最终选定洗脱液体积为5 mL。

图5 洗脱体积对回收率的影响Fig.5 Effect of eluent volume on recoveries

2.5 方法的线性范围与检出限

对6份空白藠头样品按1.4节所述步骤进行提取净化并吹干，向其残余物中依次加入用甲醇配制成的1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和100.0μg／L的系列标准溶液各1 mL，充分溶解后得到系列基质匹配标准溶液，过滤膜后进行HPLC－MS／MS分析，以目标物在MRM模式下的峰面积（Y）对相应的目标物质量浓度（X，μg／L）做标准曲线。6种化合物的回归方程、相关系数、检出限（LOD，S／N＝3）见表2。

表2 双酚－二环氧甘油醚的回归方程、相关系数和检出限（S／N＝3）Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r2）and LODs（S／N＝3）for 6 target compounds

2.6 方法的回收率与精密度

在2 g空白的藠头基质中添加适量混合标准溶液，使得藠头样品中双酚－二环氧甘油醚的含量分别为5、10、20μg／kg。按上述方法每个加标水平下平行测定6份样品，连续6 d重复操作，最终结果见表3。6种双酚－二环氧甘油醚在空白藠头中的平均添加回收率范围为78.6%～89.9%，日内、日间相对标准偏差（RSD）均小于10%；通过方法学考察发现该方法同样适用于其他罐头样品的分析。

表3 藠头样品中6种双酚－二环氧甘油醚的添加回收率及精密度（n＝6）Table 3 Average recoveries and relative standard deviations（RSDs）of 6 bisphenol diglycidyl ethers in a garlic sample（n＝6）

2.7 实际样品的测定

应用本方法测定市售不同品牌的罐头食品的色谱图见图6。其中1份鱼罐头样品中BADGE·H2O检出量为3.02μg／kg；1份莲子罐头样品中BADGE ·H2O·HCl检出量为2.23μg／kg。

3 结论

通过对样品前处理条件的优化和改进，建立了测定食品接触材料中6种双酚－二环氧甘油醚迁移量的MWCNTs－SPE－HPLC－MS／MS方法。方法简单、快速、灵敏度高，测定结果可靠，以MWCNTs作SPE柱回收率更高，重现性更好，能满足食品接触材料中双酚－二环氧甘油醚迁移量的分析要求，同时也为其他内分泌干扰物的检测提供了有利工具。

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图6 实际样品的MRM色谱图Fig.6 MRM chromatograms of real samplesa.fish canned foodstuff；b.garlic canned foodstuff.

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