虎奶菇菌丝体胞外多糖深层发酵培养基的优化

孟凡杰（农村成人高等专科学校，吉林 梨树 136500）

虎奶菇［Pleurotus tuber-regium（Fr.）Sing］又名核耳菇，隶属侧耳科的菌核，生于森林内土中的腐木或木桩上，是产于热带、亚热带地区的一种珍稀食药用菌，我国云南省滕冲、章风一带有分布，滇西南一带民间多从缅甸进口，资源十分紧缺。据《中药药名辞典》载：虎奶菌，甘，温，补气益血，治气血虚弱症。在东南亚国家华侨中及我国沿海地区，虎奶主要作为强壮补品食用，在一些民间处方中，为一味止咳平喘中药。但虎奶菌作为一种中药材在我国药典和各地地方标准中并未被收载；目前在非洲的尼日利亚、加纳、肯尼亚等正在引种栽培。福建三明也成功地引种栽培。据报道虎奶菇富含蛋白质、多糖等活性物质和钾、钙、镁等矿质元素，具有较高的营养价值和药用价值。非洲一些国家用虎奶菇治疗胃病、糖尿病、冠心病、高血压等疾病；虎奶菇还能促进胎儿发育，提高早产儿成活率；东南亚各国用虎奶菇菌核治疗痢疾。据报道，虎奶菇菌核入药，外敷有治疗妇女乳腺炎之效。迄今我国尚未开发利用。由于虎奶菇人工栽培周期长、产量低、成本高，为了开发利用虎奶菇资源，从国外引种进行栽培和发酵培养的深入研究是十分必要的。已知从各种真菌中分离出具有生物活性的物质常为多糖［1-7］、灵芝多糖、灰树花多糖等已用于肿瘤的临床治疗。经研究发现在虎奶菌核中多糖为其主要成分，占菌核干重的60％［8］。本文就虎奶菇菌丝体深层发酵培养基进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

虎奶菇：购于山东济宁光大食用菌科研中心。

1.1.2 碳源

葡萄糖，果糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，玉米淀粉，马铃薯，糊精。

1.1.3 氮源

酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，豆粕粉，麸皮。

1.2 主要仪器设备

回转式恒温调速摇床柜（无锡查桥轻机厂）；超净工作台（苏州净化设备厂）；

立式圆形压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）；

80-2型离心机（上海器械厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基的配制

斜面培养基（PDA培养基）：马铃薯20g（煮沸20min过滤取滤液）、葡萄糖2g、琼脂2g、水100g、pH值自然。

液体发酵培养基：马铃薯250g（切碎煮沸30min，用4层纱布过滤，取滤液），蔗糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，KH2PO41g，MgSO40.6g，水1000g，pH值自然。

1.3.2 培养方法

平皿培养：从母种试管中切出蚕豆大小的菌丝块接种于培养皿的中部，于25℃培养7d。

液体种子培养：将已活化的平板菌定量接种于液体种子培养基中，500mL三角瓶装培养基50mL，于25℃，150r/min摇瓶培养7d。

摇瓶条件实验：在发酵优化培养基中接入液体种子，变化相应摇瓶条件进行实验，分别测定菌体干重与胞外多糖量。

1.3.3 测定方法

菌体干重（Wd）：所得发酵液于3000r/min离心20min，去离子水洗涤后用sartrius自动水分干燥仪干燥至恒重。

总糖（Wts）：苯酚-硫酸法

胞外多糖（Wl）：发酵滤液多糖

2 结果与讨论

由于虎奶菇在我国产量较少，引种栽培也刚刚起步，液体深层发酵培养更不成型，买的这株菌常规培养下产量就很不稳定，因此需要进行简单优化。

2.1 碳源对菌丝生长及多糖产量的影响

图1 不同碳源菌体干重和多糖含量

虎奶菇作为一种担子菌，它对碳源的利用也应该相当广泛，但是不同的碳源对菌丝生长及多糖产量的影响会很大。葡萄糖、果糖、麦芽糖和糊精等都是虎奶菇菌丝体较为理想的碳源，尤其以马铃薯和蔗糖为最佳，虎奶菇菌丝体在果糖中比在葡萄糖中生长要好，说明酮糖比醛糖更容易被虎奶菇菌丝体利用，这一结论也可以从蔗糖、麦芽糖的结果差异上得到证明，麦芽糖是以两个葡萄糖为单位连接而成的双糖，蔗糖则为葡萄糖和果糖组成的双糖，结果虎奶菇菌丝体在以蔗糖作为碳源的培养基中菌丝生长量和多糖产量都高于麦芽糖。因此，综合考虑采用蔗糖和马铃薯组成的复合碳源。

2.2 氮源对菌丝生长及多糖产量的影响

由于担子菌使用无机氮作为氮源时，菌丝必须利用无机氮合成其需要的各种氨基酸，而某些氨基酸可能不能被菌体生物合成，从而影响菌丝的生长［22］。因此作者没有选用无机氮，只选择酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、豆粕粉和麸皮。结果表明除豆粕粉以外，其他四种氮源差别不大，用酵母膏时多糖产量略高一些，为0.521mg/mL，而用蛋白胨时菌体量略高一些，为1.003g/100mL，因此选用酵母膏和蛋白胨作为复合氮源较理想。使用豆粕粉为氮源时，产量非常低，这是作者没有想到的。

2.3 正交试验优化培养基组成

以上单因子实验表明，蔗糖、马铃薯、酵母膏和蛋白胨是影响虎奶菇菌丝生长和多糖产量的主要营养因子。为考虑多因子的协同作用，并确定最适用量和配比，以得到经济有效的虎奶菇菌丝体培养基组成，选用蔗糖、马铃薯、酵母膏和蛋白胨等四因子，各取三水平，进行正交试验。

表1 正交试验因素水平表L9（34）

极差分析表明，各因素对虎奶菇菌丝体干重的影响程度为：A＞B＞C=D，也就是说蔗糖是菌丝体生长的最主要因素（R=0.099），菌丝体生长理论上的最优组合为A3B1C1D2，即蔗糖3g/100mL，马铃薯20g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。对胞外多糖影响的最优组合为A2B3C2D2，即蔗糖2g/100mL，马铃薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。

由于培养虎奶菇菌丝体的目的为产多糖，结合投入与产出比，选择碳氮源的配比为：蔗糖2g/100mL，马铃薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。

表2 正交试验结果的极差分析

3 结论

虎奶菇多糖深层发酵的最佳培养基组成（g/L）为∶蔗糖2g/100mL，马铃薯25g/100mL，蛋白胨0.2g/100mL，酵母膏0.2g/100mL。在此条件下发酵产虎奶菇胞外多糖达0.5mg/100mL以上。

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