发酵法酶解菜籽粉中植物蛋白的初步研究

梁盛年

(肇庆学院 生命科学学院，广东 肇庆 526061)

0 引言

植物蛋白具有许多生理功能.例如：对肝硬化患者具有营养支持作用；能降低胆固醇水平；能减少癌症的发生；还能够改善肾脏病和心血管疾病的症状等.随着科技的进步，植物蛋白[1]的功能不断被揭示并得到发展.我国植物蛋白资源丰富，每年以大豆、花生、油菜籽、棉籽等为原料的油料产品约达1.4亿t，这些均为较好的植物蛋白资源.植物蛋白的开发利用有很多途径，近几年人们研究得最多的是棉籽[2]、菜籽[3]、大豆[4]等几种植物的蛋白水解.植物蛋白的水解方法主要有酸法、碱法和酶法[5－6].碱法和酸法工艺中的最终产物需中和反应，因盐的浓度太高，不利于使用.采用酶法进行水解，产品的颜色和味道优于碱法和酸法[2]38.本文中，笔者通过探讨微生物发酵法酶解植物蛋白在不同温度、不同物料比和不同水解时间条件下发酵液的水解度，即蛋白质的消化率，寻求较好的水解条件，为微生物发酵法酶解植物蛋白的生产工艺提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

S13菌株，能产碱性蛋白酶，由肇庆学院生命科学学院微生物实验室提供.

1.1.2 菜籽粉

本实验所用的菜籽饼在饲料市场中购得，油菜籽榨油后的饼块粉碎成粉状作为菜籽粉，约含20%～30%的蛋白质.

1.1.3 培养基[7]

1）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaC l0.5 g，100 mL蒸馏水，pH值为9.5.

2）发酵培养基：体积分数为1.5%的葡萄糖，体积分数为1.0%的酵母浸膏，Na2HPO40.4 g，NaCO30.3 g，KH2PO40.03 g，蒸馏水100 mL,pH值为9.5.

1.1.4 化学试剂

1）硫酸铜，硫酸钾，硫酸，硼酸溶液（20 g/L）和氢氧化钠溶液（400 g/L）.

2）0.010 5 mol/L盐酸标准溶液，0.047 3 mol/L NaOH标准溶液，体积分数为36%的甲醛溶液.

3）体积分数为0.1%的甲基红乙醇溶液1份，体积分数为0.1%的溴甲酚绿乙醇溶液5份，临用时将它们混合在一起.

1.1.5 实验仪器

实验所用仪器如下：标准型双人净化工作台；自动回流消化仪；微量凯氏定氮装置；干燥箱（101－1型）；微型植物粉碎机（FZ102型）；电子天平（JA5003N）；磁力加热搅拌器（79－1）；pH计（PHS－3C型）；恒温培养振荡器（SKY－200B型）；隔热式电热恒温培养箱（PYX－DHS）.

1.2 方法

1.2.1 凯氏定氮法测定菜籽粉中的蛋白质含量

按文献[8]中的方法将样品进行消化、蒸馏、滴定，并计算出菜籽粉中的蛋白质含量.

1.2.2 S13菌株活化及扩大培养

将斜面保藏的S13菌株接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，在37℃的温度下活化培养24 h后再扩接到装有发酵培养基的三角烧瓶中，调好pH值，并用恒温培养振荡器在37℃的温度下振荡培养24 h，菌液待用.

1.2.3 酶解条件及方法

取5个500 mL的三角烧瓶，分别加入5 g菜籽粉，再按1:10，1:20和1:30的比例分别加入50 mL，100 mL，150 mL的菌液摇匀；置于恒温培养振荡器上，在32℃的温度及180 r/min的条件下恒温振荡水解6 h（振荡水解过程维持pH值不变），取出，加热作酶钝化；将水解液过滤，作为测定蛋白质消化率的待测液.

按上述操作方法，再分别作35，37，40，42℃4种温度及180 r/min条件下12，24，32 h的恒温振荡水解，水解液作相同处理.以不加菌液作相同条件处理的水解液作为空白对照.

1.2.4 电位滴定法测定氨态氮[9]

1）吸取待测液5.0 mL加水定容至100 mL作为试样液.2）吸取20 mL置于100 mL烧杯中，再加入70 mL蒸馏水.3）烧杯放到磁力搅拌器上，插入酸度计，开启搅拌器，用氢氧化钠溶液进行滴定，使溶液pH值达到8.2，记录消耗氢氧化钠溶液的体积.4）加入10.0 mL甲醛溶液，混匀，用氢氧化钠溶液进行滴定，使溶液的pH值为9.2，记录消耗氢氧化钠溶液的体积V3.5)量取空白对照液作同样测定,得消耗氢氧化钠溶液的体积V4.计算公式如下：

其中，X3：样品中氨基酸态氮的质量浓度，g/L；V3：测定样品在加入甲醛后滴定至终点（pH值为9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V4：空白对照液加入甲醛后滴定至终点（pH值为9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；N：氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；0.014：与1 mL氢氧化钠标准溶液相当的氮的质量，g.

1.2.5 蛋白质消化率的计算方法

蛋白质的消化率＝X3与菜籽粉总氮之比，可以用如下公式计算：

其中，X3：样品中氨基酸态氮的质量浓度，g/L.

2 结果与分析

2.1 菜籽粉中蛋白质的质量分数测定

用凯氏定氮法测得菜籽粉中蛋白质的质量分数为25.52%.

2.2 不同酶解条件下菜籽粉中蛋白质的消化率

按实验预设的方法分别做了物料比为1:10，1:20，1:30，温度为32，35，37，40和42℃，水解时间为6，12， 24和32h的水解实验，实验结果见表1、表2和表3.

表1 不同温度条件下，物料比为1:10时处理氨态氮的消化率比较

表2 不同温度条件下，物料比为1:20时处理氨态氮的消化率比较

表3 不同温度条件下，物料比为1:30时处理氨态氮的消化率比较

从表1～3的结果可以看出，用S13菌株培养液酶解菜籽粉中的植物蛋白呈现一定的规律性:即消化率随物料比的提高而增大；它也随温度的升高而增大，到37℃时达到峰值，然后随温度升高反而下降；消化率随水解时间延长而不断增大，但24h后趋势变得很缓慢，水解率增加不大.据此，可初步确定37℃和24h为较适宜的水解条件.为进一步弄清物料比对消化率的影响，笔者补做了在37℃和24h的水解条件下，物料比为1:40和1:50时的水解实验，结果见表4.

表4 不同物料比处理氨态氮的消化率比较

从表4结果可见,当物料比进一步增大时,消化率反而下降,由此可认为物料比为1:30是较适宜的水解条件.至于水解时间对消化率的影响，从能耗方面考虑，笔者认为选24h比较适宜.

S13菌株为一杆状细菌，37℃为其最适宜的生长温度，培养24h达到生长对数期.将S13菌株用发酵培养基培养24h，在酶活力最高时将其与菜籽粉混合，让发酵液中的碱性蛋白酶直接作用于菜籽粉中的植物蛋白，将其酶解为多肽，能取得较佳的水解效果.

3 结论与讨论

用S13菌株培养液酶解菜籽粉中的植物蛋白，较好的反应条件为：温度为37℃，物料比为1:30，经24h恒温摇床振荡水解，所得蛋白质的消化率可达16.61%.

本实验得到的蛋白质的消化率约为16%，与文献[6]所报道的酶解结果比较，消化率偏低.其原因是文献[6]中使用的是纯酶，酶活性较高；而本实验是直接用产酶菌株培养24h后所产的蛋白质酶做酶解实验，所产的酶未经提纯，酶活性较低，因而所得蛋白质的消化率也较低.但与文献[3]中的酶解结果比较，本实验所得蛋白质的消化率高2%.这表明，直接应用能产蛋白酶的微生物进行植物蛋白水解的方法应有可取之处.本实验采取的方法具有操作简单、成本低、水解快速及重现性好等优点，它为进一步探索微生物发酵法酶解菜籽粉中植物蛋白的生产工艺提供了依据.

[1] 陈贵堂,赵霖.植物蛋白的营养生理功能及开发利用[J].食品工业科技,2004(9):137-139.

[2] 郭城,郑竞成.酶法水解棉籽蛋白的研究[J].中国油脂,2007,32(8):38-40.

[3] 周鸿翔,邱树毅,杨洪丹,等.风味蛋白酶水解菜籽蛋白条件研究[J].食品工程,2009(2):32-34.

[4] 卢楠,雷莹,郭立达.酶法水解大豆分离蛋白的研究[J].河北师范大学学报：自然科学版,2009,33(4):499-514.

[5] 范恒君.酶法水解植物蛋白[J].南宁职业技术学院学报,2000,3(5):57-61.

[6] 李树品,李梅,蒋千里.植物蛋白的酶法水解[J].山东科学,1997,1(3):53-56.

[7] 沈萍,范秀容,李广斌.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,1999:50-51.

[8] 张水华.食品分析实验[M].北京:化学工业出版社,2006:45-47.

[9] 王叔淳.食品卫生检验技术手册[M].2版.北京:化学工业出版社,1994：101-107.