动态观察变形链球菌luxS基因缺陷株生物膜的形成*

任志明 于丹妮 韩育植 张文娟

动态观察变形链球菌luxS基因缺陷株生物膜的形成*

任志明 于丹妮△韩育植 张文娟

目的：应用倒置荧光显微镜动态观察变形链球菌（变链菌）Ingbritt C国际标准株及luxS基因缺陷株不同时期生物膜形成的差异。方法：建立以玻片为载体的生物膜模型，分别取两菌株6、18、24、48 h的生物膜，观察不同时期两菌株生物膜与玻片的黏附程度，吖啶橙（AO）荧光染色后，倒置荧光显微镜下及时观察生物膜形态及细菌之间相对活动度，并对不同时期的生物膜标本进行处理和保存，观察3个月后倒置荧光显微镜下生物膜形态有无改变。结果：应用倒置荧光显微镜可对孔板内生物膜进行直接动态观察，镜下两菌株生物膜形态多样；6 h开始出现细菌聚集成膜，18～24 h形成最佳，与玻片黏附牢固而不易冲掉；48 h标准株生物膜附着于玻片能力较缺陷株弱，易整体滑落；两菌株生物膜标本经处理保存3个月后镜下形态未发生改变。结论：变链菌标准株与luxS基因缺陷株生物膜具有不同的空间立体结构，形态多样，且在不同时期、生物膜形态、细菌间的相互作用及黏附力不同。

链球菌，变异 基因，细菌 生物膜 吖啶橙 显微镜检查

变形链球菌（变链菌）为目前公认的口腔常见致龋菌，牙菌斑是典型的生物膜，为龋病和牙周病发生的始动因子。luxS基因是密度感应分子AI-2形成所必需的，在变链菌生物膜的形成过程中起着重要作用[1-2]。本实验通过建立变链菌标准株及luxS基因缺陷株的生物膜模型，采用活性染料吖啶橙（AO）改进法进行染色，倒置荧光显微镜下观察两菌株不同时期的生物膜，以明确luxS基因对变链菌生物膜形成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验菌种 实验菌种为变链菌（S．mutans）Ingbritt C（血清c型）国际标准株，购自四川大学口腔医学研究所，以下简称标准株；luxS基因缺陷株由本实验室成功构建并保存[3-4]，以下简称为缺陷株。

1.2 培养条件 液体培养基为牛心脑浸液培养基（BHI），pH值约为7．4；固体培养基为BHI琼脂（北京陆桥生物制品公司），其中含有50mg/L红霉素的BHI琼脂用以选择性培养缺陷株。1.3 主要设备及试剂 倒置荧光显微镜（Nikon Ti－u日本）；隔水式电热恒温厌氧箱（WGP－600上海）；微量加样器（Eppendod公司，德国）；紫外分光光度计（BECKMAN公司，美国）；标准 24孔微量板（Costar 3524，Coming Inc美国）；直径为12 mm圆形盖玻片（江苏盐城市恒泰玻璃仪器厂）。吖啶橙（AO）染剂（sigma）；抗荧光衰减封片剂（北京索莱宝科技有限公司）；1%HCl溶液、CaCl2溶液（11．1 g/L）以及 PBS缓冲液（本实验室配制）。

1.4 菌悬液制备 将从-70℃冰箱中取出的变链菌Ingbritt C标准株和luxS缺陷株常规复苏，接种于BHI琼脂培养基，37 ℃厌氧条件下（80%N2，10%H2，10%CO2，以下相同）培养48 h，分别挑取单菌落转种于BHI液体培养基，37℃厌氧条件下培养过夜。涂片检查为纯培养后用PBS缓冲液充分混匀，于紫外分光光度计600 nm处调整菌悬液光密度（OD）值约为0．1备用。

1.5 生物膜形成和染色 在标准24孔微量板中放入12 mm×12 mm的盖玻片，取菌液各500 μL滴至盖玻片表面，再向孔板中加入1 mL BHI液体培养基，置厌氧箱培养6、18、24、48 h，空白对照即将空白盖玻片放入孔板，加入等量BHI培养液，每个时间点菌液一式两份，实验重复3次。将A1（6 h标准株），A3（6 h缺陷株），B1（18 h标准株），B3（18 h缺陷株），C1（24 h标准株），C3（24 h缺陷株），D1（48 h标准株），D3（48 h缺陷株）孔板中培养液吸干，用PBS缓冲液轻轻冲洗，以去除表面未黏附菌，自然干燥10 min，固定生物膜，每张盖玻片上滴10 μL固定液，成分比例为冰醋酸∶氯仿∶无水乙醇＝1∶3∶6，然后用 0．01%的 AO 进行染色。染色过程：0．01%的AO染色4 min→PBS缓冲液20 s→CaCl2溶液（11.1 g/L）20 s→PBS缓冲液20 s→1%HCl溶液2 min→PBS缓冲液冲洗20 s→暗室条件下孵育10 min，最后加入1 mL PBS缓冲液，直接用倒置荧光显微镜观察，氩激光（488～515 nm），物镜×40，目镜×10。将 A2（6 h 标准株），A4（6 h 缺陷株），B2（18 h标准株），B4（18 h缺陷株），C2（24 h标准株），C4（24 h缺陷株），D2（48 h标准株），D4（48 h缺陷株）各时间点载有两菌株生物膜的盖玻片取出，用1 mL PBS缓冲液轻轻冲洗玻片表面浮游菌，经干燥，固定，然后将盖玻片固定于无菌载玻片上，再用0．01%AO进行染色（方法同上），最后滴加5 μL抗荧光淬灭液于生物膜上封片，置于倒置荧光显微镜下观察，条件同上，镜下观察前后均避光低温保存。

2 结果

2.1 细菌生物膜的形成 在24孔微量板底部培养6 h后，肉眼可见变链菌标准株和缺陷株均有生物膜形成，空白对照组未见生物膜形成；18~24 h生物膜形成最佳且与玻片黏附牢固而不易冲掉。标准株形成的生物膜光滑、完整且分布均匀，呈乳白色；而同时期luxS缺陷株生物膜形态较标准株粗糙，薄而分散，呈灰白色。

2.2 AO染色后倒置荧光显微镜下两菌株生物膜形成的观察 镜下可见两菌株生物膜均呈绿色荧光。标准株生物膜均匀，完整地黏附于盖玻片上，细菌呈长链且相互缠绕，聚集呈均匀团块，团块之间的间隙较小，见图1～4。且在6、18 h均可见组成生物膜的细菌之间有不规则的相对运动，24、48 h时细菌之间缠绕紧密，呈云团状，细菌间动度明显减弱；缺陷株生物膜明显不同于标准株，镜下可见其分布不均，细菌多呈短链，聚集呈较大团块，生物膜团块间有明显较大的间隙，呈筛孔状，见图5～8。在6、18、24、48 h时间点均可见构成生物膜的细菌有不规则运动。

2.3 两种菌株生物膜标本特点及保存 将盖玻片取出过程中发现24、48 h标准株生物膜较缺陷株易整体脱落，采用吖啶橙染色改进法并滴加抗荧光衰减封片剂后，低温避光保存标本，3个月后仍可见到如上所示两菌株不同时间点的生物膜清晰图像。

3 讨论

生物膜是由微生物相互黏附形成的复杂混合物，大部分形成于物质表面，牙菌斑是一种附着于牙面的软而黏稠，含有大量细菌且不易被清除的物质，为人们研究最详尽的生物膜之一，其形成分两个连续步骤，早期菌细胞沉积在物质表面，然后相互依附的多层细菌繁殖积累，此过程包括细菌细胞间相互作用而发生黏附[5]。黏附材料可选择玻片、硝酸纤维膜、羟基磷灰石、牙釉质磨片等，本实验采用Menit等[2]的方法，以玻片为载体建立生物膜模型，操作简单，便于染色及镜下观察。

吖啶橙为一活性染料，可与细胞中核酸物质特异性结合，在氩激光激发下产生绿色或红色荧光，当细菌处于静止期或不活动状态时为绿色荧光，因其核酸主要为双螺旋DNA，大多数自然界的细菌均为绿色荧光；在死菌细胞中DNA被破坏为单链DNA，与吖啶橙反应呈红色荧光，处于高速生长的细菌，因RNA占优势，也呈红色荧光，当红与绿色荧光混合时，肉眼看到的为黄色荧光[6]。本实验采用吖啶橙改进法染色生物膜在孔板内直接观察，更加直观地比较两种菌株不同时期生物膜形成的形态差异，及细菌的生存状态。将玻片取出，染色后采用抗荧光淬灭液封片，能够减缓荧光衰减。本实验证实在低温避光保存下，其应用能够增加生物膜标本使用的次数，延长可供使用的时间。

生物膜生长周期可分为最初定植阶段、不可逆黏附阶段、结构的分化和成熟阶段以及膜细胞脱落再定植阶段[7]。本实验通过倒置荧光显微镜连续动态观察，发现标准株生物膜中细菌聚集成团，呈多样、开放的特点；而luxS缺陷株生物膜不均匀分布，团块间形成较大间隙，表明luxS基因在生物膜形成中起到重要作用；24、48 h标准株较同时期的缺陷株动度明显，表明标准株形成的生物膜中细菌之间的相互作用较强。标准株24 h之后生物膜易于脱落，而缺陷株形成的生物膜难以清除，考虑原因可能是胞外不溶性多糖如葡聚糖具有很强的黏性，促进细菌细胞间的黏附聚集,其合成需要gtfB及gtfC，luxS基因缺失引起葡聚糖转移酶基因gtfB及gtfC上调，产生的水不溶性葡聚糖较标准株多。国外在对luxS基因缺陷株生物膜研究中也有类似报道[2]。

本实验通过采用吖啶橙荧光染色改进法结合倒置荧光显微镜对变链菌标准株和luxS基因缺陷株生物膜进行动态观察，此种方法便于操作，并能够直观地反映luxS基因在变链菌生物膜形成中的功能作用，为进一步探索luxS基因的致龋毒性提供了新的途径。

[1]Huang Z,Meric G,Liu Z,Ma R,et al.luxS-Based Quorum-Sensing Signaling Affects Biofilm Formation in Streptococcus mutans[J].J Mol Microbiol Biotechnol,2009,17(1):12-19.

[2] Menit J,Qi F,Goodman SD,et al.Mutation of luxS affects biofilm formation in Streptococcus mutan[J].Infect and Immun,2003,71(4):1972-1979.

[3] 于丹妮，韩育植，韩福胜，等．变形链球菌AI-2活性测定及luxS基因同源重组质粒的构建 [J].中华口腔医学杂志，2008,43(1):37-40．

[4] 于丹妮，韩福胜,韩育植，等．LuxS基因缺失的变形链球菌突变株的构建及鉴定[J].中华微生物学和免疫学杂志,2008,40(3):58-62.

[5] O'Toole G,Kaplan HB,Kolter R.Biofilm formation as microbial development[J].Annu Rev Microbiol,2000,54:49-79.

[6] Caldwella DE,Korberb DR,Lawrenceb JR.Imaging of bacterial cells by fluorescence exclusion using scanning confocal laser microscopy[J].J Microbiol Methods，1992,15(4):249-261.

[7] Singh R,Stine OC,Smith DL,et a1.Microbial Diversity of Biofilms in Dental Unit Water Systems[J].Environ Microbiol,2003,69(6):3412-3420.

Dynamic Observation of Streptococcus Mutans LuxS Mutant in Biofilm Formation

REN Zhi ming,YU Danni,HAN Yuzhi，ZHANG Wenjuan
Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300020,China

Objective：To study the difference of biofilm formation at different times by dynamic observation of converted fluorescence microscope between Streptococcus mutans Ingbritt C international standard strain and LuxS mutant strain.Methods：The biofilm models of both Streptococcus mutans standards strain and luxS mutant strain were built on the slide carriers in 6,18,24,48 h respectively,in order to study the adhering levels between the biofilm and slides of two kinds of strains in different periods.Then the biofilm specimens were processed and preserved for three months,observing whether there was any change in the microscopic appearances of the specimens.The biofilms of the two strains and the relative mobility were observed using converted fluorescence microscope after dyeing by means of acridine orange(AO)between the bacteria.Results:The biofilms in the microtiter plates could be observed dynamically by converted fluorescence microscope.There were varieties in morphology of the two stains.The biofilms began to form the bacteria gathering densely at 6 h.Those of 18 h and 24 h were the best formation.They can adhere to slide carrier very firmly and can not be washed out.At the time of 48 h,the adhesive capacity of the standard strain was lower than that of luxS mutant strain.The whole biofilm of the standard strain was prone to slide.There were no changes in biofilm specimens of two kinds of strains in different periods after three months.Conclusion:The biofilms of Streptococcus mutans standard strain and luxS mutant strain were three-dimensioned and variety in morphology.In addition,at different point-in-times,they displayed a marked difference in the form of biofilm,reciprocity of bacteria and adhesive power.

streptococcus mutans genes,bacterial biofilms acridine orange microscopy

*天津市应用基础研究计划面上项目（项目编号：06YFJMJC06900）

300020 天津医科大学研究生院（任志明，张文娟）；天津医科大学第二医院（于丹妮，韩育植）

△通讯作者 E-mail:danni2468@eyou.com

（2010-06-15收稿 2010-08-02修回）

（本文编辑 魏杰）

论著