星座美洲海鞘次级代谢产物的研究*

陈 立,顾谦群

(1.福州大学生物和医药技术研究院,福建福州350002;2.中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003)

星座美洲海鞘次级代谢产物的研究*

陈 立1,2,顾谦群2**

(1.福州大学生物和医药技术研究院,福建福州350002;2.中国海洋大学医药学院,海洋药物教育部重点实验室,山东青岛266003)

从采自青岛近海的星座美洲海鞘(Amaroucium constellatum)70%乙醇提取物中分离得到9个次级代谢产物。经波谱(MS、NM R)分析和文献比对,确定了它们的化学结构分别为尿嘧啶(1)、胆甾醇(2)、十九碳甘油醚(3)、胸腺嘧啶(4)、反-4-对羟基苯基-3-丁烯-2-酮(5)、反-4-苯基-3-丁烯-2-酮(6)、对胺基苯乙酸(7)、胸腺嘧啶脱氧核苷(8)和N-甲基尿嘧啶核苷(9)。其中,化合物2～3,5～7,9均为首次从该海鞘中分离得到。

星座美洲海鞘;次级代谢产物;结构鉴定;抗肿瘤活性

自然界中已知有1 500余种海鞘,主要分布在热带和亚热带地区[1]。近年来众多研究表明,海鞘中含有许多结构新颖、活性多样的次级代谢产物,其结构类型主要包括生物碱类、肽类、萜类、大环内酯类以及多硫化合物等,生物活性有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、诱导肌浆网释钙物质等。其中,最有代表性的当属抗肿瘤药物海鞘素-743(ET-743),ET-743是从一种加勒比海鞘Ecteinascidia turbinata中发现的生物碱,是一种DNA结合药物。它对各种实体瘤细胞系具有抗性,包括软组织肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌以及黑色素瘤等[2]。现已被欧盟承认为治疗软组织肉瘤和卵巢癌的孤药[3]。

我国海鞘资源丰富、种类繁多,目前已发现有103种之多[4],仅有少数几个种属的海鞘的次级代谢产物进行了报道。其中,俎成立等从柄海鞘中发现了大量的甾类衍生物、甘油酯、苯类和碱基等[5-7];王超杰等从冠瘤海鞘中分离到甾类、神经酰胺、甘油醚、核苷等[8-9],从皱瘤海鞘中分离到甾类和神经酰胺等[10];王艳红等也从长纹海鞘中发现了胆甾醇和神经酰胺[11];徐秀丽等从美洲海鞘(又称列精海鞘)正丁醇部分分离到5个碱基与核苷[12]。可见,目前国内对海鞘来源天然产物及其相关生理活性的研究尚处于起步阶段,对海鞘次级代谢产物及其活性进行研究具有广阔前景。

为了寻找结构新颖的抗肿瘤活性先导化合物,本实验室对青岛及周边海域多种海洋附着生物的抗肿瘤活性进行了筛选。在筛选过程中,发现星座美洲海鞘(Am aroucium constellatum,又称星座列精海鞘)的乙酸乙脂层萃取物在100μg/m L浓度下对小鼠乳腺癌tsFT210细胞有诱导凋亡活性(见下图),正丁醇层萃取物在100μg/m L浓度下对该细胞有细胞毒活性。于是决定对该海鞘的乙酸乙酯和正丁醇萃取物的化学成分分别进行研究。

经过大规模富集、乙醇提取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取以及各种柱层析,共分离得到9个次级代谢产物。经波谱(M S、NM R)分析和文献比对,确定了它们的化学结构分别为尿嘧啶(1)、胆甾醇(2)、十九碳甘油醚(3)、胸腺嘧啶(4)、反-4-对羟基苯基-3-丁烯-2-酮(5)、反-4-苯基-3-丁烯-2-酮(6)、对胺基苯乙酸(7)、胸腺嘧啶脱氧核苷(8)、N-甲基尿嘧啶核苷(9)。其中,化合物2,3,5-7,9均为首次从该海鞘中分得[12]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

质谱用Q-TOF UL TIMA GLOBAL GAAO76 LC型质谱仪,核磁共振谱用日本JEOL JNM -ECP600型核磁共振仪测定。分析用高效液相色谱仪:Waters公司产品(Waters 600,Waters 996二极管阵列检测器,M illennium32工作站,Capcell Pak C-18柱(4.6 mm×250 mm,5μm)。制备用高效液相色谱仪:日本岛津公司产品,LC-6AD,SPD-M 20 AVP检测器,SCL-10AV型系统控制器,Capcell Park C-18柱(10 mm×250 mm,5μm)。柱色谱及薄层色谱用硅胶H(10～40μm)(青岛海洋化工集团公司)。SephadexTML H-20(Pharmacia公司)。活性测试采用小鼠温敏型乳腺癌tsFT210细胞。流式细胞术采用美国BD公司Vantage型流式细胞仪。胎牛血清(FBS)和RPM I-1640细胞培养基分别为Hyclone公司(Cat.No.STF721)和Gibcobrl公司产品。丽丝胺罗丹明B(SRB,Sigma公司)。

1.2 海鞘的采集与处理

1.2.1 海鞘的采集与鉴定 该海鞘采自青岛沿海潮间带。经中国科学院海洋研究所黄修明研究员鉴定为星座美洲海鞘(A maroucium constellatum)。

1.2.2 提取分离 将新鲜采集的海鞘(干质量:5 kg)用匀浆机匀浆后,70%乙醇室温浸提4次,滤液合并后减压浓缩至无醇味。将浓缩液稀释至10 L,依次用等体积乙酸乙酯和正丁醇分别萃取4次,浓缩后得乙酸乙酯层粗提物(15.2 g)和正丁醇层粗提物(18.9 g)。乙酸乙酯层粗提物经硅胶减压柱色谱石油醚-氯仿-甲醇体系洗脱得到3个组分。其中组分1再次经硅胶加压柱色谱石油醚-乙酸乙酯洗脱得化合物2(28.9 mg),3(15.2 mg);组分2经凝胶柱色谱(氯仿∶甲醇=1∶1)后高效液相制备得化合物5(35.7 mg),6(5.9 mg);组分3经凝胶柱色谱(甲醇)后高效液相制备得化合物1(12.2 mg),4(15.4 mg)。正丁醇层粗提物经硅胶减压柱色谱氯仿甲醇洗脱后分成4个组分,其中组分2经凝胶柱色谱(甲醇)得到化合物7(7.8 mg)、组分3经凝胶柱色谱(甲醇)后高效液相制备得到化合物8(6.7 m g)和9(8.9 mg)。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

化合物1 白色结晶,该化合物的阳离子ESI-M S在m/z 225处给出[2M+H]+峰,在m/z 247,263处给出[2M+Na]+和[2M+K]+峰,结合1H-NMR数据确定其分子式为C4H4N2O2。1H-NMR(DMSO-d6)δ:11.03(1H,s,2-NH),10.84(1H,s,4-NH),7.40(1H,d,J=7.7Hz,H-5),5.44(1H,d,J=7.7Hz,H-6)与文献[13]对照分析,可以确定化合物1为尿嘧啶。

化合物2 白色针状结晶,Lieberman-Burchard反应阳性,说明该化合物是甾醇类化合物。该化合物1HNMR谱在高场区出现5个甲基信号δ0.68(3H,s);0.81(3H,d,J=6.6Hz);0.83(3H,d,J=6.9Hz);0.92(3H,d,J=6.6Hz);1.01(3H,s)。同时在δ5.35(1H,m)有1个sp2杂化氢质子;δ3.52(1H,m)处有1个连氧的次甲基。与文献[14]对照,确定该化合物为胆甾醇。

化合物3 白色粉末,该化合物的阴离子ESI-M S在m/z 357处给出[M-H]-峰,结合1H NM R和13C NM R数据确定其分子式为C22H46O3。1H-NMR(CDCl3)δ:3.68(2H,m,H-1),3.87(1H,m,H-2),3.51(2H,m,H-3),3.45(2H,m,H-1’),1.58(2H,m,H-2’),1.25-1.30(32H,m,H-3’-18’),0.88(3H,t,J=6.9Hz,H-19’),2.51(2H,brs,OH);13C-NM R(CDCl3)δ:71.8(t,C-1),70.4(d,C-2),64.2(t,C-3),72.5(t,C-1’),31.9(t,C-2’),22.7-29.7(t,C-3’-18’),14.1(q,C-19’)。结合文献[15],该化合物为1-十九碳甘油醚。

化合物4 淡黄色针晶,该化合物的ESIM S在m/z 253处给出[2M+H]+峰,在m/z 275处给出[2M+Na]+峰,结合1H NM R和13C NM R数据确定其分子式为C5H6N2O2。1H-NM R(CD3OD)δ:7.22(1H,s,H-6),1.84(3H,s,H-7);13C-NM R(CD3OD)δ:153.7(s,C-2),167.5(s,C-4),110.4(s,C-5),139.2(d,C-6),12.1(q,C-7)。与文献[14]对照分析,可以确定化合物4为胸腺嘧啶。

化合物5 淡黄色粉末,该化合物的阴离子ESI-M S在m/z 161处给出[M-H]-峰,结合1H NM R和13C NM R数据确定其分子式为C10H10O2。1H-NMR(CDCl3)δ:2.40(3H,s,H-1),6.61(1H,d,J=16.1Hz,H-3),7.52(1H,d,J=16.1Hz,H-4),7.45(2H,d,J=8.5Hz,H-2’,H-6’),6.92(2H,d,J=8.5Hz,H-3’,H-5’),7.66(1H,brs,OH);13C-NM R(CDCl3)δ:27.2(q,C-1),200.2(s,C-2),124.2(d,C-3),144.9(d,C-4),126.3(s,C-1’),130.4(d,C-2’,C-6’),116.2(d,C-3’,C-5’),159.0(s,C-4’)。结合文献[16],可以确定化合物5为反-4-对羟基苯基-3-丁烯-2-酮。

化合物6 淡黄色粉末,该化合物的阳离子ESI-M S在m/z 169处给出[M+Na]+峰,结合1H NM R数据确定其分子式为C10H10O。1H-NM R(CDCl3)δ:2.39(3H,s,H-1),6.58(1H,d,J=15.8Hz,H-3),7.53(1H,d,J=15.8Hz,H-4),7.40(2H,d,J=7.8Hz,H-2’,H-6’),7.25(2H,t,J=7.8Hz,H-3’,H-5’),7.32(1H,t,J=7.8Hz,H-4’),结合质谱和文献[17],可以确定化合物6为反-4-苯基-3-丁烯-2-酮。

化合物7 白色晶体,阴离子ESIM S给出分子离子峰[M-H]-m/z:150,由于1H NM R(CD3OD)只有3个氢信号,判断该化合物为对称结构,核磁仅给出了一半的信号。1H NMR显示7.01(1H,d,J=7.6 Hz)和6.53(1H,d,J=7.6 Hz)各有1组双重峰,提示分子中存在对位取代苯环。此外还有1个亚甲基(1H,3.35,s)。结合文献[18],分析该化合物为:对-胺基苯乙酸。化合物8 无色针晶,熔点186～187℃,阳离子ESIM S在m/z 243处给出准离子峰[M+H]+,在m/z 265处给出准离子峰[M+Na]+,推测分子式为C10H14N2O5。1H NM R(CD3OD)δ:1.87(3H,d,J=0.9Hz,5-M e),7.81(1H,d,J=0.9Hz,H-6),6.27(1H,t,J=6.9Hz,H-1’),2.22(2H,m,H-2’),4.39(1H,m,H-3’),3.89(1H,m,H-4’),3.72(1H,dd,J=11.9,3.7Hz,H-5a’),3.78(1H,dd,J=12.3,3.3Hz,H-5b’);13C-NMR(CD3OD)δ:152.4(s,C-2),166.4(s,C-4),111.5(s,C-5),12.4(q,5-Me),138.2(d,C-6),86.2(d,C-1’),41.2(t,C-2’),72.2(d,C-3’),88.8(d,C-4’),62.8(t,C-5’)。综合以上信息并与文献[14]对照,确定该化合物为胸腺嘧啶-2′-脱氧核苷。

化合物9 白色晶体。阳离子ESI-M S给出准分子离子峰m/z 259[M+H]+,提示其分子量为258,与分子式C10H14N2O6相符。1H NM R(CD3OD)δ:5.69(1H,d,J=8.4Hz,H-1),8.01(1H,d,J=8.4Hz,H-2),3.59(3H,s,H-7),5.89(1H,d,J=4.5Hz,H-1’),4.16(1H,overlapped,H-2’),4.16(1H,overlapped,H-3’),3.99(1H,m,H-4’),3.72(1H,dd,J=11.5,3.5Hz,H-5a’),3.82(1H,dd,J=11.5,3.5Hz,H-5b’)。结合质谱数据,对照文献[19]可以确定该化合物为N-甲基尿嘧啶核苷。

2.2 抗肿瘤活性测试

根据之前本实验室对核苷类化合物的抗肿瘤活性筛选报道[20]:化合物8(胸腺嘧啶-2′-脱氧核苷)在100 μg/m L时,对tsFT210细胞抑制率达77.24%;在50 μg/m L时抑制率为26.43%;在25μg/m L时为10.22%。

2.3 讨论

通过本项研究,首次从该海鞘中分离得到化合物2～3,5～7,9,并率先对其乙酸乙酯层成分进行报道。实验结果表明,星座美洲海鞘的乙酸乙酯层和正丁醇层粗提物主要成分是核苷类化合物和苯的衍生物。核苷类化合物是临床治疗血液性恶性肿瘤和实体肿瘤的基本药物,目前应用于临床的和正在研究的核苷类抗肿瘤药物有数十种。它们主要作用是干扰肿瘤的DNA合成、影响核酸的转录过程、抑制蛋白质的合成等,从而达到治疗肿瘤的效果。例如:治疗急性粒细胞白血病的阿糖胞苷以及治疗肝癌、胃癌、乳腺癌的5-氟尿嘧啶等。据此推测,核苷类化合物应该是该动物粗提物抗肿瘤活性的主要成分。

[1] 王超杰,苏镜娱.海鞘中抗肿瘤活性物质的研究概况[J].有机化学,1997,17:481-487.

[2] 耿越,刘靓雯,张薛.海鞘类天然产物的临床研究进展[J].中国海洋药物,2004,23(5):55-60.

[3] 王晔,刘站柱,陈世智,等.抗肿瘤天然产物Ecteinascidin-743的研究进展[J].中国医学科学院学报,2004,26(4):474- 478.

[4] 贺诗水,成永旭.海鞘的药用价值及其研究进展[J].上海水产大学学报,2002,11(2):167-170.

[5] 俎成立,顾谦群,方玉春,等.柄海鞘Styela clava化学成分的研究(Ⅱ)[J].青岛海洋大学学报,2000,30(2):255-258.

[6] 俎成立,顾谦群,方玉春.海鞘中一种酚类衍生物的分离与结构鉴定[J].青岛海洋大学学报,1999,29(1):53-56.

[7] 顾谦群,俎成立,方玉春,等.柄海鞘Styela clava化学成分的研究[J].中国海洋药物,2000,19(1):4-6.

[8] 王超杰,苏镜娱,曾陇梅.冠瘤海鞘Styela canopus的化学成分研究[J].中国海洋药物,2000,19(1):1-3.

[9] 王超杰,韩光,苏镜娱,等.冠瘤海鞘的化学成分[J].分析化学,2001,29(2):168-170.

[10] 王超杰,苏镜娱,曾陇梅.皱瘤海鞘的化学成分研究[J].分析化学,2001,29(11):1311-1314.

[11] 王艳红,苏镜娱,曾陇梅.长纹海鞘(Ascidia longistriara)的化学成分研究[J].中山大学学报,1999,38(2):118-120.

[12] 徐秀丽,宋福行,范晓,等.列精海鞘化学成分研究[J].时珍国医国药,2008,19(11):2632-2633.

[13] 赵婷婷,李晓明,李景梅,等.海洋红藻多管藻内生真菌EN-22的化学成分研究[J].海洋科学,2009,33(7):81-86.

[14] 苏国琛,张偲,漆淑华.海角珊瑚的化学成分研究[J].中草药,2008,39(11):1606-1609.

[15] Taguchi H,Paal B,A rmarego W.Glyceryl-ether monooxygenase[EC 1.14.16.5].Part V III.Probing the nature of the active site[J].Pteridines,1995,6(2):45-57.

[16] Ayer W A,Singer P P.Phenolic metabolites of the bird’s nest fungus Nidula Niveo-tomentosa[J].Phytochemistry,1980:19:2717-2721.

[17] Bellassoued M,Majidi A.A simple and highly stereoselective route to E-α,β-unsaturated aldehydes[J].J Org6 Chem,1993,58:2517-2522.

[18] Bromilow J,Brownlee R T C,Craik D J,et al.Carbon-13 substituent chemical shifts in the side-chain carbons of aromatic systems:the importance ofπ-polarization in determining chemical shifts[J].J Chem Soc,Perkin Trans.2,1981:753-759.

[19] El-Tayeb A,Qi A,Muller C E.Synthesis and structure-activity relationships of uracil nucleotide derivatives and analoguesas agonists at human P2Y2,P2Y4,and P2Y6receptors[J].J Med Chem,2006,49:7076-7087.

[20] 赵文英,顾谦群,朱伟明.海绵共附生放线菌SH6004菌株中抗肿瘤活性成分的研究[J].中国海洋大学学报:自然科学版,2008,38(1):23-26.

Chemical Study on Secondary Metabolites from Ascidian Amaroucium constellatum

CHEN Li1,2,GU Qian-Qun2
(1.Institute of Biomedical and Pharmaceutical Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350002,China.2.Key Laboratory of Marine Drugs,Ministry of Education,School of Medicine and Pharmacy,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Nine compounds were isolated from 70%alcohol extract of ascidia Amaroucium constellatum,collected from Qingdao sea area,China.Their structures were elucidated by various spectral analysis(M S,NM R)and comparison of their chemical and physical data with samples reported in literatures.Compounds 2～3,5～7 and 9 were first reported to be isolated from Ascidia Amaroucium constellatum.

Am aroucium constellatum;secondary metabolites;structure determination;antitumor

Q591

A

1672-5174(2010)12-111-04

国际合作重点项目(2005DFA 30030-4)资助

2010-06-04;

2010-09-29

陈 立(1981-),男,博士,助理研究员。E-mail:cli81cli81@163.com

**通讯作者:E-mail:guqianq@ouc.edu.cn

责任编辑 徐 环