植物脂质转运蛋白的研究

李长生　赵传志　李爱芹　李兴圃　赵光敬　王兴军

摘要：植物脂质转运蛋白(Lipidtransfer protein，LTP)是一类小分子碱性蛋白，占植物可溶性总蛋白的4％左右，目前已经在许多植物中克隆了LTP的编码基因。LTP是一种多功能的蛋白，除了被认为参与了磷脂在生物膜之间的运输外，LTP还在生物膜、角质和脂质的形成、植物的生殖发育以及信号的转导等生物过程中发挥了重要的作用，另外LTP作为一种食物过敏原和防御蛋白引起了科研人员越来越多的兴趣。本文综述了LIP的生物学功能，对LTP在农业上的应用前景做了展望。

关键词：脂质转运蛋白；过敏原；植物防御

中图分类号：Q946.1文献标识号：A文章编号：1001—4942(2009)08—0013—05

脂质转运蛋白(upid transfer protein,LTP)，又被称为磷脂交换蛋白(Phosphdi，did@xchangeprotein，PIEP)，1975年首次在马铃薯块茎中发现，是一类分子量为7～11 ku的碱性小分子蛋白。植物中LTP含量高，占可溶性蛋白的4％左右，被认为是植物生命活动的一种重要活性蛋白。在1998年第五届国际植物病程相关蛋白专题研讨会上，LTP被列入植物病程相关蛋白(PRs)家族，并被命名为PR—14。LTP在植物中普遍存在，目前关于LTP在拟南芥、玉米、水稻、棉花、小麦、番茄、辣椒、油菜等作物和蔬菜中的研究比较深入。LTP的生物学功能呈现出多样性和复杂性，LTP基因也存在多态性。LTP基因在植物中属于一个小的多基因家族，从辣椒中已经分离到6个LTP基因，拟南芥中分离到15个LTP基因，水稻全基因组测序发现了53个非特异LTP基因，这些不同的LTP基因编码相似的蛋白，但是不同的LTP基因的表达模式不尽相同。除了被认为能在离体条件下参与磷脂、脂肪酸、糖脂等在生物膜之间的运输外，LTP还在生物膜、角质和脂质的形成，植物的生殖发育以及信号的转导等生物过程中发挥着重要的作用。作为一种防御蛋白，LTP在植物抵抗病原菌的侵染以及适应胁迫的环境中起着重要作用。因此，通过基因工程的手段过量表达LTP基因，增强作物的抗病和适应不良环境的能力，培育作物抗逆新品种，在实际生产中有重要意义。

1植物脂质转运蛋白

1.1脂质和植物脂质转运蛋白

脂质(1ipids)又称类脂，是生物体中一大类不溶于水而溶于有机溶剂的有机化合物，主要包括脂肪酸、磷脂、糖脂、类萜、类固醇、蜡等。其中磷脂、糖脂等是植物叶绿体、线粒体等细胞器生物膜的重要组成成分，而叶绿体、线粒体等并没有合成脂质的能力，Kader等在研究脂质是如何从合成之处转运到这些受体细胞器的过程中发现了脂质转运蛋白。LTPs在体外能够可逆地结合和转运多种疏水分子，如磷脂、糖脂、脂肪酸、乙酰辅酶A／类固醇、芳香衍生物及角质单体等脂类复合物。LTPs相对热、化学变性、酶的消化稳定性很高。LTPs蛋白的一级结构在不同物种中同源性不高，一般只有30％～70％氨基酸相同，但都具有LTP蛋白的结构和特性。LTPs N端一般都含有一个由21-29个氨基酸组成的信号肽序列，包含有8个半胱氨酸残基，由4个保守的二硫键按照固定模式排列。根据分子量的大小LTP可以分为两大类：LTP I和LTPⅡ，LTP I定位于细胞壁，分子量约为lO ku，由90～95个氨基酸组成，主要存在于植物地上部分的组织和器官；LTPⅡ分子量约为7 ku，由大约70个氨基酸组成，主要存在于根部。LTP I和LTPⅡ在N端都有一段信号肽序列，并且具有基本相同的二级结构。X射线晶体衍射和核磁共振研究表明LTP分子的三维结构具有一个向内的疏水腔，Kader推测LTPs疏水腔和磷脂分子酰基链的结合是实现磷脂在膜之间转运的基础。

1.2植物脂质转运蛋白在细胞中的定位

植物LTP是一类胞外分泌型蛋白，在细胞内的定位比较复杂。对拟南芥、水稻、蓖麻的免疫细胞学研究表明，LTP定位于细胞壁上，并可能在内质网形成后全部进人内质网腔，然后通过高尔基体分泌到细胞外。

2植物脂质转运蛋白基因及表达调控

2.1不同植物脂质转运蛋白基因的克隆和序列分析

1986年，Mundy等从玉米中扩增到650个碱基的cDNA序列，同源比对后被定义为a-淀粉酶抑制子。1988年Tchang等通过构建玉米幼苗的eDNA文库，筛选克隆了玉米LTP编码基因的部分eDNA序列，这是对LTP编码基因的首次明确报道，同时也证实Mundy等1986年克隆的a-淀粉酶抑制子编码序列也是LTP基因。此后拟南芥、水稻、烟草、油菜等的LTP基因部分编码序列相继报道。截止到2009年5月7日，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中登录的编码植物LTP基因的EST有4 850条，其中来自大豆的1726条，棉花548条，花生121条，烟草94条，拟南芥48条，水稻37条，番茄21条。为了进一步说明LTP基因的结构和特点，随机选取以上几个物种的LTP基因(见表1)，用DNAstar将这些基因的开放阅读框(ORF)翻译成氨基酸序列并预测了分子量的大小，结果表明这些LTP的分子量介于9.9～11.9 ku之间，推测均属于LTP I家族。

用DNAMAN软件和多序列比对软件Clust-alW(1.83)分析表明，这10个LTPs基因氨基酸序列相似性为44.09％(图1)，8个半胱氨酸残基的数量和位置相同，而且c端的保守性相对N端要高。SignalP在线软件(http://www.ebs.dtu.dk／serviees／SignalP／)分析结果表明，花生和棉花LTPs基因信号肽长度较短，只有20个氨基酸残基，其它植物LTP基因的信号肽长度介于20-29个氨基酸之间，而且信号肽剪切位置相对固定。通过DNAsmr对以上LTPs基因进行亲／疏水性分析，获得了LTPs基因的亲／疏水曲线(图2)，表明LTPs基因的肽链具有较大的疏水面，特别是在N端有几个连续的氨基酸残基组成的疏水性肽段，从另一个侧面说明这段序列具有信号肽的特征。

2.2植物脂质转运蛋白基因的表达调控

不同物种LTP基因的表达模式不尽相同，同一物种中LTP基因的表达具有较强的发育和组织特异性。普遍认为LTP基因在幼嫩组织中比在老化组织中表达要强，在花的发育过程中LTP基因只在早期表达，在根中没有表达。Thoma等证实LTP基因在拟南芥的花、角果和叶片中表达，在根中没有表达。在拟南芥营养生长期，LTP基因在胚的表皮原细胞、微管组织、子叶顶端、茎尖的分生组织中表达；生殖生长期在嫩叶、茎、花、角果、子房外壁、柱头、花瓣和萼片中均

有表达。Lee等研究发现LTP I基因在拟南芥的表皮、茎皮层、维管束、叶肉细胞、花粉及种子中均有表达，在根尖中也发现了LTP基因的表达，但不同组织中的表达量有明显差异。

作为植物一种重要的防御蛋白，LTP基因的表达受到干旱、高盐、低温等逆境胁迫因子的诱导。Maghuly等研究发现LTP基因能够对低温、高温、高盐、机械伤害作出应答，实时定量PCR结果显示，在受到以上逆境因子诱导后LTP基因的表达量在叶片大幅上调。而在根中却有轻微下调的趋势。LTP基因对不同胁迫因子诱导的反应不尽相同，而且在同一植株不同组织和器官中表达情况也不一样：例如在大麦中，低温、干旱等不能诱导LTP基因的表达，而高盐和脱落酸能够诱导LTP基因的表达；被高盐、高温和脱落酸处理的番茄LTP基因只在茎中表达。LTP基因也能够对病原菌的侵染和一些信号分子(水杨酸、脱落酸、乙烯等)作出响应，例如大麦接种病原真菌12 h后，LTP基因上调9倍。

3脂质转运蛋白在植物抗逆中的作用

3.1植物脂质转运蛋白和非生物胁迫

越来越多的证据表明LTP在植物抗逆和适应不良环境中发挥着重要的作用。Dirk等首次证明LTP蛋白是一种冷调节蛋白，在低温胁迫下具有稳定质膜的功能；Liu等在绿豆中克隆了2个LTP基因，Vrltpl和Vrltp2，证明LTP基因在水胁迫处理过程中有重要作用，且特异地存在于生长的茎组织中。尽管很多的分子机制还不是很清楚，但LTP基因对其它逆境因子(ABA、NaCl、甘露醇、PEG等)的应答反应，预示着LTP基因在植物抗逆(盐碱、低温、干旱)中扮演着重要角色。李诚斌等从巴西旱稻中克隆到全长的OsLTPl基因，构建过量表达载体转化水稻日本晴，证明转基因植株具有较强的耐盐能力。

3.2植物脂质转运蛋白和生物胁迫

LTP属于植物病程相关蛋白(PRs)，它能被病原菌诱导而高水平表达，并能抑制病原菌的生长和诱导植物系统抗性的产生。越来越多的证据表明，LTPs在体外具有抗菌能力：Molina等将从大麦中纯化的脂质转运蛋白(LTP2)用基因枪转人烟草的叶片，与对照相比病原细菌丁香假单胞杆菌在烟草叶片上的生长受到了明显的抑制。Ge等通过水稻的LTPl0基因的原核表达，纯化得到LTP蛋白，证明LTP蛋白在体外能有效地抑制稻瘟病菌孢子的萌发，而且在较低浓度(66 mg／L)下也可以发挥作用。

通过过量表达LTPs基因也能提高转基因作物对病原菌的抗性：Rajesh等利用玉米泛素基因的启动子驱动LTP基因，构建表达载体并转化水稻，过量表达LTP基因的水稻能够有效抑制稻瘟病菌、立枯病和水稻黄单胞菌的侵染，转基因后代对水稻三大病害——稻瘟病、纹枯病和白叶枯病的抗病能力分别提高了86％、67％和82％。抑制LTPI和LTPⅡ基因的表达使辣椒容易受到茄科细菌性斑点病和胡椒斑点病毒的感染，而过量表达则增强了其对真菌病、烟草黑胫病、细菌病、烟草野火病的抗性”。表明LTPs基因在体内和体外都具有抗菌能力，不仅可以通过体外的途径有效抑制植物病原菌的发作和流行，而且可以利用基因工程手段通过增强LTPs基因的表达来提高作物的抗病能力。

Molina等研究发现不同种的病原细菌和真菌对LTP的敏感程度不同，甚至同种不同株系间对LTP的敏感程度也存在差异；不同植物来源的LTP在体外抵抗微生物的能力也有明显差异。例如洋葱的LTPs具有广谱的抗性，玉米和小麦的LTPs只有很低的抗微生物能力；同一植物来源的LTPs对不同植物病害的抵抗能力也不相同，如来源于蓖麻种子的LTPs对镰刀茵、腐霉菌和丝核菌等真菌以及一些革兰氏阳性细菌有明显的抑制效果，但对一些革兰氏阴性细菌没有作用。Park等研究发现烟草花叶病毒侵染后，辣椒LTP基因的表达水平显著提高，由此推测LTP可能有抗病毒的功能。

4植物脂质转运蛋白在其它方面的研究进展

除上述功能外，LTPs还可能参与了生物膜、角质和脂质的合成。另外，LTPs和花粉的发育密切相关，Sang等研究发现LTP促进了百合花粉管和柱头基质的粘合，是花粉黏附到柱头基质的必需物质之一。进一步研究发现，LTP在花粉的水合作用以及花粉管的伸长方面也起着重要作用。LTP还能提高细胞壁的伸展性，促进细胞壁的伸长；另外，在细胞程序化死亡过程中，LTPs起到了保护细胞免受蛋白酶水解的作用。LTP也参与了植物表皮层的形成，还是重要的过敏原。LTP在植物的生殖发育以及信号转导等生物过程中也发挥了重要的作用。

5小结

脂质转运蛋白在植物生命活动的很多方面行使着重要的生理、生化功能。近年来对LTP的研究取得了很大的进展，但仍有许多问题需要继续深入研究。LTPs在脂质流传递的过程中转运脂质的机制是什么?虽然科学家给出了几个合理的假说，但一直没有强有力的证据证明。关于LTPs的抗病机制研究也存在很多争论，假说一认为脂质转运蛋白可能干扰了激发素触发的植物细胞致死性过敏反应；假说二认为LTP通过可能的信号传递途径以及参与角质屏障的形成来增强植物的防御机能，另外还有研究证明LTPs自身对真菌也有一定的致死能力，是不是多种机制的协同作用还有待进一步研究。随着研究的深入，LTPs将在生物农药的开发、作物抗逆、抗病育种中发挥越来越重要的作用。