尼尔雌醇对产后雌性黄鳝性腺转化及发育的影响

龚道兰，杨代勤，李 涛 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

尼尔雌醇对产后雌性黄鳝性腺转化及发育的影响

龚道兰，杨代勤，李 涛 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

在饵料中分别添加0、4、8、12、16 μg/g尼尔雌醇，对产后雌鳝(Monopterusalbus)进行为期8周的饲养试验，以观察黄鳝性腺转化及发育状况。结果表明：随着尼尔雌醇投喂浓度的增加，黄鳝卵巢成熟系数逐步增大；对照组黄鳝的性腺表现为乳白色细索状的精巢样组织，而其他4个试验组黄鳝均保持为卵巢外观。其中，剂量为4 μg/g和8 μg/g时的试验组黄鳝卵母细胞以Ⅲ～Ⅳ时相为主，剂量为12 μg/g和16 μg/g的则以Ⅴ时相为主，对照组性腺组织中以开始发育的精原细胞为主，及少量败育的Ⅴ～Ⅳ时相卵母细胞，说明尼尔雌醇对黄鳝的产后卵巢存在不同程度的维持效应，从而延缓性转变时间。

黄鳝(Monopterusalbus)；性逆转；尼尔雌醇

黄鳝(Monopterusalbus)亦称鳝鱼，是我国重要的淡水名优鱼类之一，由于生长快、成活率高以及对网箱养殖条件的适应性好、养殖经济效益高，是一种极具发展前景的水产养殖品种。但由于黄鳝怀卵量少，又存在性逆转，导致了雌性黄鳝的个体小、个体繁殖力低、雌雄个体大小不协调等问题，极大地限制了黄鳝繁殖苗种的规模。

人工投喂或注射外源性性激素是控制鱼类性别的有效途径，国内外应用天然激素作为外源性激素控制鱼类性转化的研究已经取得显著成效[1～4]，而采用半合成雌激素诱导鱼类雌性化的报道尚少。尼尔雌醇是一种主要作为补充雌激素替代治疗，调整植物神经系统，改善绝经后引起的骨质疏松，抗辐射以及改善内外生殖器官的局部条件的半合成雌激素类药[5]。相关研究主要集中在医学领域，目前临床用于雌激素缺乏引起的妇女绝经期或更年期综合征，而在动物应用上报道较少，仅限于兔、鼠的研究性试验，在水产动物养殖上尚未见报道。

本研究通过对产后雌鳝进行为期8周的外源性雌激素尼尔雌醇的投喂，探讨了不同剂量的尼尔雌醇对产后雌鳝性别的维持效果与性腺的发育情况，以期能获得大规格成熟度高的雌鳝亲本用于其苗种生产。

1 材料与方法

1.1 材料

受试黄鳝来源于长江大学动物科学学院黄鳝养殖基地催产繁殖后的个体，体长30～45 cm，体重50～140 g，健康雌鳝。尼尔雌醇为上海华联制药厂生产，分析纯，批号：6903741051017。

1.2 方法

将试验黄鳝经过10 d室内控温循环水养鱼系统暂养，适应该养殖环境之后，选取体质健康的黄鳝75尾，根据所投喂饵料中尼尔雌醇含量的不同而分为5组，其添加剂量分别为4、8、12、16、0 μg/g(对照组)，每组3个平行，共15个塑料水族箱饲养，每箱养鱼5尾，初始体重组间无差异。

试验于2007年8月10日至10月15日在长江大学黄鳝养殖基地室内控温循环水养鱼系统进行，该养鱼系统采用塑料水族箱的规格为54 cm×42 cm×30 cm，养殖用水为经充分曝气的自来水，保持溶氧量gt;6.5 mg/L，氨氮量lt;0.102 5 mg/L，室温由制冷空调稳定在(25±1) ℃，水温保持在25℃。每日18：00时定点投饲，按体重的5%投喂含尼尔雌醇的饵料，投喂的饵料为白鲢肉糜。

饲喂56 d后将黄鳝体表擦干，准确称量其体重，随后解剖并分离性腺，外观鉴别雌、雄并准确称取性腺重，固定于8%福尔马林液。48 h后石蜡切片，H.E法染色，制成厚度为7 μm的性腺连续切片，光学显微镜观察。

黄鳝性腺和生殖细胞的分期均参照周定刚等[6]和肖亚梅[7]的方法，根据生殖腺内生殖细胞发育状况，将黄鳝雌性发育阶段划分为6个时相。

性腺成熟系数(GSI)(%)=性腺重/体重×100

1.3 数据处理

使用SPSS 11.5统计软件包进行数据处理和检验分析。成熟系数采用单因素方差分析(ANOVA)中的Duncan’s多重比较进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同剂量尼尔雌醇对黄鳝性腺外观形态的影响

采用不同剂量尼尔雌醇饲喂产后黄鳝56 d后，肉眼可见对照组黄鳝性腺呈线状，为乳白色精巢组织(图1e)，其他各试验组黄鳝的性腺均为卵巢，肉眼可见处于不同发育阶段的卵粒。投喂剂量为4 μg/g试验组和其他3个试验组相比，其黄鳝性腺外形规整，呈明显清晰的黄色且质地均匀而透明(图1a)，而在投喂剂量为8 μg/g、12 μg/g和16 μg/g的3个试验组中，黄鳝性腺虽然表现卵巢的外观，但卵巢的外部形态变得不规则，从颜色看均表现出不同程度的退化状态(图1b～d)。

a：4 μg/g；b：8 μg/g；c：12 μg/g；d：16 μg/g；e：0 μg/g(对照组)。图中箭头所指为性腺。图1 投喂不同剂量尼尔雌醇后黄鳝的性腺外观Figure 1 The outer appearances of gonads in rice field eel after being fed with different levels of nilestriol

投喂剂量/(μg/g)0481216性腺成熟系数/%1.632.082.023.865.08

随着投喂剂量的增加，8 μg/g、12 μg/g和16 μg/g的3个试验组黄鳝性腺的成熟系数有逐步增大的趋势，其性腺成熟系数分别为2.02%、3.86%和5.08%(表1)。而在4 μg/g和8 μg/g的2个试验组中，其性腺成熟系数分别为2.08%和2.02%，差异不显著(Pgt;0.05)。总体而言，各试验组所对应的性腺成熟系数均明显大于对照组的1.63%，其中12 μg/g和16 μg/g试验组的性腺成熟系数与对照组相比有显著增大(Plt;0.05)。

2.2 尼尔雌醇对黄鳝卵巢发育的影响

采用不同添加剂量的尼尔雌醇投喂产后黄鳝后，4个试验组黄鳝的组织切片均显示黄鳝的性腺发育处于雌性发育阶段。生殖腺囊中存在着大量的各时期的卵母细胞，同一生殖腺囊内的生殖细胞发育呈明显的不同步性。投喂剂量为4、8 μg/g时，黄鳝卵母细胞以Ⅲ～Ⅳ时相为主；而在投喂剂量为12、16 μg/g时，黄鳝卵母细胞则以Ⅴ时相为主。

(1)4 μg/g剂量组黄鳝的卵粒发育良好， 卵巢以Ⅲ～Ⅳ时相的卵母细胞为主。卵巢中卵母细胞形状较为规则，呈多角形或圆形，有的存在细胞核，有的细胞核消失，但胞质均匀且明显可见卵粒中积累有较为致密的卵黄。部分卵母细胞的卵膜周围存在空隙。卵母细胞排列较松散，有相当数量的空滤泡存在(图2A1～A4)。

(2)8 μg/g剂量组黄鳝的卵巢中以Ⅲ时相的卵母细胞为主。与4 μg/g的试验组相比，其卵巢中卵母细胞排列紧密，卵母细胞胞质部分虽可见卵黄积累但存在空的间隙，空滤泡相对较少，Ⅲ时相卵母细胞为主，有少量Ⅳ时相卵母细胞。因此，从组织学上看，与4 μg/g剂量组相比，该试验组对于维持卵巢的功能和延缓黄鳝的性逆转更为有效(图2B1～B4)。

(3)12 μg/g剂量组黄鳝的卵巢以败育的Ⅴ时相卵母细胞为主。卵巢中卵母细胞体积变大且排列十分紧密，胞质疏松且出现数量多达几十个的空泡，细胞核溶解，卵黄充满整个卵母细胞，看不见细胞核，核质溶解。该浓度下黄鳝卵巢的卵粒开始败育，绝大多数卵细胞看不见细胞核，有细胞核的细胞其细胞核则偏移于一侧(图2C1～C4)。

(4)16 μg/g剂量组黄鳝的卵巢同样以败育的Ⅴ时相的卵母细胞为主。卵巢的组织结构与12 μg/g的试验组大体相似，但卵母细胞排列相对疏松，部分卵母细胞有细胞核，偶见空滤泡(图2D1～D4)。

(5)对照组黄鳝卵的巢极度退化，其生殖腺大部分呈乳白色块状，精原细胞开始发育，并有少量败育的Ⅴ～Ⅳ时相卵母细胞和产后的空滤泡腔分布于乳白色性腺块中，卵母细胞发白、形态不规则且分布十分松散(图2E1～E2)。

从以上结果可以看出，随着尼尔雌醇使用剂量的增加，促进卵巢发育作用的效果越明显，表明尼尔雌醇可延缓黄鳝的性逆转。

3 讨论

鱼类属低等脊椎动物，其中少数鱼雌雄同体，分为同时性雌雄同体和相随性雌雄同体2种类型[8]。刘建康[9]、Liem[10]﹑Chan[11，12]等国内外学者研究表明，黄鳝为相随性雌雄同体，且是雌性先熟型雌雄同体，即从胚胎到性成熟期都是雌性，雌性性成熟产卵后，卵细胞败育，卵巢逐渐退化，同时，分布于生殖腺上的原始精原细胞开始生长发育，然后向雄性过渡，发生性变化后不再由雄性个体逆返为雌性个体[8]。

早在1962年，Reinboth[13]就推测激素可能在性逆转中起重要作用。至今为止，尽管其作用机制尚不清楚，但激素参与性逆转是无可非议的。用一定剂量的雌二醇喂养Clariaslazera一段时间，解剖后发现，大部分实验鱼的生殖腺是卵巢，只有小部分残留于卵巢表面部分是精巢，其结果显示，雌二醇已基本上将其由遗传性雄性改变为功能性雌性。Tang[14]认为，哺乳动物的促黄体生成激素能刺激黄鳝的性反转，在所有处理鱼中都能刺激间质细胞的发育，约有百分之七十的鱼发育的精巢小叶显示活跃的精子发生。而且不同激素对控制黄鳝性逆转的有效作用时期不同。Yeung等[15]证实哺乳类的促黄体生成素(luteinizing hormone, LH)能促进黄鳝性转变，但是仅对产卵后的雌鳝有效，LH对产卵前期的雌鳝没有诱导性转变的效果。石琼等[16]发现，由此排卵时及排卵后,褪黑激素影响黄鳝性腺进一步发育的作用不大。推测褪黑激素对性腺发育产生显著影响的关键时间可能是在静止期,亦即Ⅳ期或/和Ⅳ期之前。赵云芳等[17]用合成雌激素乙烯雌酚注射未产卵的12尾黄鳝，经过一年饲养后发现黄鳝性腺全表现为Ⅲ～Ⅳ期卵巢，雌性保持率和怀卵量均明显大于对照组。该试验结果也表明雌性激素可延缓黄鳝的性逆转，即雌性激素对黄鳝卵巢具有维持效应。本试验中的4个试验组，性腺均表现为以卵母细胞为主，而对照组的性腺已经表现为精巢的组织学结构，再次验证雌性激素对黄鳝卵巢的维持作用。

A1～A4：4 μg/g；B1～B4: 8 μg/g； C1～C4:12 μg/g； D1～D4: 16 μg/g；E1～E2: 0 μg/g(对照组) NO:有核卵母细胞;DF:退化卵泡;KO:胞核溶解的卵母细胞;TT:精巢组织图2 投喂不同剂量尼尔雌醇后黄鳝卵巢的组织切片图Figure 2 Histological micrographs of rice field eels’ ovarian sections after being fed with different levels of nilestriol addition

在鱼类的成功性转换试验中,外源激素的投喂剂量都存在一定范围。国内外资料[11，17]指出，甲基睾丸酮的投喂量有一适宜的剂量范围,剂量过大会使生殖腺萎缩。本试验的4个试验组中，投喂剂量为4 μg/g、8 μg/g时，黄鳝性腺的成熟系数在2.0%左右，投喂剂量为12 μg/g、16 μg/g的黄鳝性腺的成熟系数则在3.5%～5.5%之间，均大于对照组的1.63%。周定刚等[6]的研究表明，黄鳝在5 月下旬至7 月下旬(繁殖季节)，由于卵母细胞积累大量卵黄，其体积成倍增加，性腺成熟系数达到5.87%～15.91%的高峰值。由于本试验在8～10月份进行，因此性腺的成熟系数与繁殖季节相比，均明显下降。由此看来，投喂大剂量的雌激素可能对产后黄鳝卵巢的发育更具有激发和维持效应。

与此同时，考虑到试验鱼取样时间为10月份，这个时候出现Ⅲ时相以后的卵细胞到繁殖季节细胞败育的可能性比较大，故认为生殖腺中以不出现Ⅲ时相以后的卵母细胞为好。所以在生产中如果用尼尔雌醇来延缓雌鳝性逆转，饵料中的适宜尼尔雌醇药物浓度可能为8 μg/g。但不同剂量的尼尔雌醇等半合成雌激素药物对产后黄鳝卵巢功能的长期维持效应(如一个繁殖周期)，还有待于进一步研究。

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2008-09-18

国家“十一五”支撑计划项目(2007BAD37B04)；湖北省“十一五”科技攻关项目(2006AA203A02)

龚道兰(1984-)，女，湖北公安人，硕士研究生，研究方向为名特水产养殖.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.01.015

Q175;Q959.482

A

1673-1409(2009)01-S048-06