水稻矮缩病毒基因组遗传多样性的初步研究

章松柏 吴祖建，段永平，王 盛 林奇英，谢联辉

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025；福建农林大学农药生物化学教育部重点实验室，福建 福州 350002)(福建农林大学农药生物化学教育部重点实验室，福建 福州 350002)

水稻矮缩病毒基因组遗传多样性的初步研究

章松柏 吴祖建，段永平，王 盛 林奇英，谢联辉

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025；福建农林大学农药生物化学教育部重点实验室，福建 福州 350002)(福建农林大学农药生物化学教育部重点实验室，福建 福州 350002)

田间调查发现，云南、福建两地的水稻矮缩病症状存在差异。生物学接种实验排除了水稻品种引起这种差异的可能性。通过10%SDS-PAGE对福建、云南两地的7个水稻矮缩病毒分离物基因组遗传多样性进行分析，结果表明基因组之间存在明显差异，主要体现在S2、S3、S11、S12 4个基因片段上，其中S2、S3片段之间的差异与症状差异有地域上的一致性，推测这4个基因片段中的一个或几个与病毒的致病性相关。

水稻矮缩病毒；遗传多样性；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

水稻矮缩病毒(Rice Dwarf Virus, RDV)是隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)中的植物呼肠孤病毒属(Phytorevirus)成员[1]，主要由黑尾叶蝉(Nephotettixcincticeps)、电光叶蝉(Reciliadorsalis)和二条黑尾叶蝉(N.nigropictus)以持久方式且可经卵传播[2～4]。该病毒引起的水稻矮缩病广泛地分布于中国、日本及菲律宾南部等水稻产区，造成水稻严重减产[5]。近年来在我国福建、云南、河南等水稻产区又有局部流行的趋势[6]。水稻矮缩病的典型症状是在苗期至分蘖期染病后，植株矮缩，分蘖增多，叶片浓绿、僵直，生长后期病稻不能抽穗结实，始病叶以上新叶都出现点条斑。但是在福建和云南两省进行调查时发现，侵染RDV的水稻病株症状存在明显的差别，福建病株都呈现典型的矮化症状，高度一般只有健株的一半，分蘖增多，其病稻不能抽穗结实，而很多采自云南的病株矮化症状并不明显，能正常分蘖、抽穗和结实。

植物病毒病症状差异的原因往往与植物病毒基因组遗传多样性密切相关，而植物病毒的株系分化和分子变异在自然界中广泛存在。由于病毒致病性的变异，往往导致品种抗性的丧失，因此，对病毒致病性分化和基因变异进行研究，是非常迫切的任务。日本学者首先发现RDV在自然条件下存在基因变异，深入研究了RDV的遗传多样性以及其与致病性之间的关系[7]，从而发现RDV不同株系间致病力存在很大差异。为了研究田间调查过程中发现的福建、云南水稻矮缩病病株外部症状差异的原因，对两地采集的水稻矮缩病毒基因组进行了研究，以初步揭示基因组遗传差异与外部症状差异的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻矮缩病代表性病株于2001～2003年采自福建福州、龙岩、松溪和云南农大、西山、禄劝、武定等地，分别编号为RDV-FZ(福州)、RDV-SX(松溪)、RDV-LY(龙岩)、RDV-ND(云南农大)、RDV-LQ(禄劝)、RDV-WD(武定)、RDV-XS(西山)，经过接种纯化后，种植于防虫网室。

介体昆虫黑尾叶蝉采自福建省农科院水稻所无病试验田。

水稻矮缩病感病品种为台中1号水稻品种。

1.2 生物学接种

将采集的RDV-FZ(福州)、RDV-SX(松溪)、RDV-LY(龙岩)、RDV-ND(云南农大)、RDV-LQ(禄劝)、RDV-WD(武定)、RDV-XS(西山)等7种分离物接种到水稻矮缩病毒感病品种台中1号水稻品种上，种植于防虫网室，观察发病情况。

1.3 dsRNA病毒基因组的提取

病毒基因组(dsRNA)的提取参考周雪平(1995)等[8]病株中直接提取病毒基因组的方法，略有改进。步骤如下：采集以上7种分离物具有典型症状的水稻病叶，液氮研磨成粉末。用2倍体积的2×STE及酚、氯仿抽提，低速离心。上清液用无水乙醇调至含量为17%，注入用含17%乙醇的1×STE平衡过的纤维素(CF-11)柱中，然后用80 mL含17%乙醇的1×STE洗脱，再用不含乙醇的1×STE洗脱，洗脱液用乙醇沉淀后真空抽干，即为RDV-dsRNA。

1.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

提取的病毒dsRNA基因组加等体积2×凝胶加样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl、pH8.0，2%巯基乙醇，4% SDS，0.2%溴酚兰，20%甘油)煮沸10 min，取4 μL加样于10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。采用TBE缓冲体系，165 V，16 h。EB染色或银染观察结果。

2 结果与分析

2.1 生物学接种结果

表1 RDV 7种分离物在原水稻品种和感病品种台中1号的表现Table 1 The performances of original or Taizhong No.1 rice varietie inoculated by 7 RDV isolates

将采集的7种分离物接种到感病品种台中1号上，种植于防虫网室，观察发病情况。结果如表1。症状的差异主要由两种原因引起的：(1)病毒的基因组差异，导致致病性存在差异，从而引起自然寄主发病差异；(2)水稻品种抗病性的差异。从表1可得知，生物学接种结果符合田间调查发现，说明这种症状差异不是水稻品种不同所导致的，推测与病毒基因组差异相关。

2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

RDV 福州(RDV-FZ)、松溪(RDV-SX)、龙岩(RDV-LY)、云南农大(RDV-ND)、禄劝(RDV-LQ)、武定(RDV-WD)、西山(RDV-XS)等7个地方分离物的10% SDS-PAGE电泳图谱如图3.4(其中A为银染，B、C为EB染色)。图谱显示：福建、云南两地的RDV7种分离物的基因组dsRNA存在明显的遗传多样性，基因组差异体现在S2/S3、S11/S12 4个基因片段上，其中S2/S3之间的差异有地域性，即福建分离物和云南地方分离物在S2/S3上存在地理差异。而田间调查发现福建、云南两省的各分离物其引起的水稻矮缩病的症状存在较大的差异，生物学接种实验排除了水稻品种引起这种差异的可能性，推测与病毒基因组差异相关。暗示这4个基因片段中的一个或几个可能与水稻的矮化症状相关。

RGDV,水稻瘤矮病毒；ND、LQ、WD、LY、SX、XS、FZ：水稻矮缩病毒分离物图1 RDV分离物基因组10%聚丙烯酰胺电泳图谱Figure 1 10% PAGE showing dsRNA profiles from some RDV isolates rice dwarf gall virus

3 讨论

植物病毒的株系分化和分子变异在自然界中广泛存在。株系分化和分子变异为病毒分类、分化和抗病育种以及病毒生物功能和机制的比较研究提供重要材料和依据。我国幅员辽阔，各地生境千差万别，RDV分布地理跨度极大，很有可能产生新株系，引起遗传多样性和致病性变化。由此可见RDV遗传多样性研究具有重要的理论和应用意义。本研究初步分析了RDV基因组的遗传多样性。通过生物学接种和致病性测定首先排除水稻矮缩病症状差异由水稻品种导致，明确症状差异是有基因组差异引起的。在此基础上对症状上有差异的7个病毒分离物的基因组遗传多样性进行了初步分析，显示S2、S3、S11、S12存在较明显的差异。值得注意的是，S2/S3片段之间的差异与症状差异具有一致的地域性。所以推测S2/S3、S11/S12这4个基因片段中的某一个或多个片段与病毒致病性有一定的关系。这种推测与报道中的一些推测相符合[9～11]。因此，这4个基因片段中的一个或几个可能与水稻的矮化症状相关，值得进一步研究。进一步研究的重点可放在S2/S3、S11/S12这4个差异基因片段的核酸序列分析和比较上，找出可能与致病性相关的基因片段，在此基础上进行分子间互作研究。

[1]van Regenmortel M H V,Fauquet C M,Bishop D H L.Taxonomy,classification and nomenclature of viruses: Seventh report of the international committee on taxonomy of viruses [M].New York,San Diege: Academic Press,2000.622～627.

[2]林奇英，谢联辉．传带水稻矮缩病毒的二点黑点叶蝉[J]．福建农业科技，1982，(3)：24～25．

[3]Lin Q Y,Xie L H.A new insect vector of Rice dwarf virus[J].IRRN,1981,6(5):14.

[4]陈声祥．水稻病毒病发生现状及研究进展[J]．浙江农业科学，1996，(1)：41～42．

[5]谢联辉，林奇英．中国水稻病虫综合防治进展[M]．杭州：浙江科学技术出版社，1988．255～264

[6]乔玉昌,王 阳，黄雅柯,等.水稻矮缩病毒病及其防治[J].湖北农业科学,2003,(1):12.

[7]Uyeda I,Ando Y,Murao K,etal.High resolution genome typing and genomic reassortment events of rice dwarf phytoreovirus[J].Virology,1995,212:724～727.

[8]周雪平，李德葆．双链RNA技术在植物病毒研究中的应用[J]．生物技术,1995,5 (1):1～4．

[9]Yan J,Tomaru M,Takahashi A,etal.P2 protein encoded by genome segment S2 of rice dwarf phytoreovirus is essential for virus infection[J].Virology,1996,224:539～541.

[10]Tomaru M,Maruyama W,Kikuchi A,etal.The loss of outer capsid protein P2 results in nontransmissibility by the insect vector of rice dwarf phytoreovirus[J].Jounal of Virology,1997,71:8019～8023.

[11]Chen D Y,Patton J T.Rotavirus RNA Replication Requires a Single-Stranded 3` End for Efficient Minus-Strand Synthesis[J].Jounal of Virology,1998,72:7387～7396.

2009-08-31

国家自然科学基金项目(39900091)

章松柏(1978-)，男，湖北黄梅人，农学硕士，讲师，主要研究方向为分子植物病毒学.

吴祖建，E-mail:zujianwu@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.011

Q346+.5

A

1673-1409(2009)04-S037-03