应用植物酯酶测定农药残留研究进展

2009-11-29姚安庆李俊凯

长江大学学报(自科版) 2009年8期

关键词：氨基甲酸酯显色剂酯酶

韩波，姚安庆，王勇，李俊凯

(长江大学农学院，湖北荆州 434025)

应用植物酯酶测定农药残留研究进展

韩波，姚安庆，王勇，李俊凯

(长江大学农学院，湖北荆州 434025)

植物酯酶主要用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测。对有机磷、氨基甲酸酯类农药的植物酯酶检测原理、应用条件、固定化研究现状和检测方法作一概述，以展望其广阔的市场远景。

植物酯酶；农药残留；有机磷；氨基甲酸酯

农药的不合理使用，导致农药在环境以及食物中的残留量严重超标，由此引起的农药中毒现象和农产品贸易中引发的争端时有发生，因此发展可靠、灵敏、快速、实用的农药残留快速检测分析技术无疑是监测和控制残留、保证农产品安全和避免国际贸易争端的重要前提[1]。传统的农药残留检测方法存在选择性差、灵敏度低等缺陷；近年来发展较快的仪器分析方法具有灵敏度极高、选择性好、分析迅速、适于微量、超痕量组分的测定等特点，能有效准确地测定样品中农药残留含量，但往往需要昂贵的仪器和专业的操作人员，费时费力，且不适合现场实时检测[2]；而快速的基于酶抑制原理的检测技术[3]势将成为食品生产或产品销售时农药残留检测及控制的重点研究对象。

目前在农药残留检测过程中所用酯酶包括来自动物体内的如从果蝇或电鳗中[4]提取的乙酰胆碱酯酶、马血清中得到的丁酰胆碱酯酶以及从小麦、水稻、玉米、毛豆、黄豆、蚕豆、小白菜[5～7]等植物中提取的植物酯酶；但胆碱脂酶来源于动物体[8]，价格贵且保存较为困难；而植物酯酶来源广、成本低、易于保存[9]；因此近年来有研究用植物水解酶替代乙酰胆碱酯酶的分析方法[10,11]，结果发现在酶活性和抑制程度上有些植物酶与动物酶相比并不逊色[12,13]，且其测定农药残留的最低检出限远低于国家规定的最大允许残留量(MRL)[14,15],因此用植物酶进行抑制反应的检测完全可行。

1 植物酯酶检测农药残留的原理

植物酯酶抑制法是通过酶与食品中含有的农药反应后，底物与显色剂反应的比色原理测定食品中农药残留量。这种方法具有灵敏度高、结果可靠、测量时间短、且检测体系容易实现等特点。基于其比色原理，有可能实现的测定方法有固蓝B盐法、靛酚乙酯法等。

1.1 植物酯酶固蓝B盐法检测的原理

固蓝B盐法的依据是农药能抑制植物酶的活性，而酶被抑制的程度可以用比色法来测定。当酶与试样进行反应时，如果试样中没有农药残留或者残留量极小，酶的活性不被抑制，基质可以水解，水解产物通过显色剂显色；反之，如果农药残留量较高，酶的活性就会被农药所抑制，水解产物减少或者没有产物生成，不能显色或显色较浅。该方法的显色反应原理如下[16]：

植物酯酶可以使乙酸-α-萘酯酶水解为萘酚和乙酸，萘酚与显色剂固蓝B盐作用形成紫红色偶氮化合物，从而完成显色反应。酶被抑制的程度不同，紫红色偶氮化合物的产量不同，溶液颜色的深浅也不同。依据该原理可以衡量出植物酯酶的比活力，比较受农药抑制时的酶活性和未受农药抑制时的酶活性，可以求出农药的抑制率。与乙酰胆碱酯酶相似，可以通过农药残留量与酶活性抑制率之间的关系，测定抑制率的大小来显示农药残留的毒性程度。

1.2 植物酯酶2,6-二氯靛酚乙酯法检测的原理

在pH 7.0～8.0的溶液中，碘化硫代乙酰胆碱被植物酯酶水解，生成硫代胆碱。硫代胆碱具有还原性，能使蓝色的2,6-二氯靛酚乙酯褪色，褪色程度与酯酶活性正相关，可在600 nm附近比色测定，酶活性越高时，光密度越低。当样品提取液中有一定量的有机磷农药或氨基甲酸酯类农药存在时，酶活性受到抑制，光密度则较高，光密度与农药残留量呈正相关。据此可以判断样品中有机磷农药或氨基甲酸酯类农药的残留情况。反应方程式如下：

采用植物酯酶法测定残留农药时，根据农药残留量与光密度之间的关系，通过光密度的变化来显示农药残留的毒性等级。

2 植物酯酶反应条件的研究

由于植物酯酶是一种生理活性物质，在使用过程中经常会受到试验条件及方法的限制而不能够充分发挥其对农药的显著抑制效果，因此有学者对酯酶在试验时所涉及到的反应pH、温度、浓度等方面进行研究。

徐斐等[17]利用酶法分析中的酶抑制原理，在不同pH条件下对可被有机磷农药抑制的不同来源的植物酯酶进行了筛选。以总酯酶活力和对敌敌畏的灵敏度为指标，确定从豫麦39中提取的植物酯酶为最佳的农药检测用酶，其最佳检测pH为6.5。

周艳明[18]等从荞麦面粉中提取得到植物酯酶，经硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析后酶活性可提纯16.814倍。纯化后酶液经Sephadex G-200层析和HPLC分析证明为单一物质。酶作用的最适温度为45 ℃，最适pH为6.5，在 40 ℃以下、pH 6.5～8.0之间酶的活性较稳定。

黄保宏[19]采用比色法对不同温度下植物酯酶活性进行研究，结果表明：不同温度对植物酯酶活力的影响较为显著(Plt;0.05)。小麦内乡188幼苗内植物酯酶是偏热性酶，随反应温度的变化而呈偏正态分布，45 ℃时光密度值△D达最大值，以后酯酶活性则呈下降趋势。故以45 ℃时植物酯酶活力最佳，且为植物酯酶测定有机磷农药残留的最佳温度。

肖建军等[20～22]以乐果为抑制剂对各种小麦酯酶进行了筛选，结果表明，不同品种小麦酯酶对乐果的敏感度不同；针对这种情况，作者选出酯酶对有机磷抑制敏感的小麦品种，确定酶适宜的催化条件，以便于对农药的准确测定，并且进一步研究了酶浓度与温度对检测灵敏度的影响。

在农药残留检测的过程中，采用农药为抑制剂时，为了提高分析结果的灵敏度，酶的浓度应较低。采用植物酯酶利用分光光度法检测农药含量，在进行微量分析时，酶的浓度存在一个最适浓度，用此浓度的酶进行分析，分辨率较高，灵敏度也较高。酶的浓度高于或低于此浓度，分辨率都会下降。酶活性受温度的影响较大，不同的植物酯酶都有一个最适温度。低于此温度时，酶促反应速度随温度的增加而提高；高于该温度时，反应速度随温度的增加而降低。肖建军等[23]为研究小麦酯酶作为检测农药残留量生物传感器的生物敏感元件的可行性，研究了小麦酯酶在室温20 ℃和4 ℃保存时、在经历低温后及在液氮中保存后酶活性的变化情况。研究显示，小麦酯酶在室温和4 ℃保存时，其活性衰退较快，有必要对其进行低温保存。在液氮中停留20 min或保存34 h后，小麦酶活性仍能维持很高；在液氮中保存8 d，活性仍有97.5%。

3 植物酯酶固定化的研究

所谓固定化酶(Immobilized Enzyme)是通过物理的或化学的方法，将酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以重复使用，它是酶制剂中的一种新剂型。酶的固定方式有吸附法、包埋法、结合法、交联法、热处理法等。由于固定化酶的研究已取得大量的成果，发挥着巨大作用，因此受到人们极大的关注。

许学勤[24]以大孔径强碱性阴离子交换树脂作为固定化载体，采用离子结合法，在室温及酶液对载体比例为4 mL∶l g的条件下，对酶固定化的环境pH、缓冲液浓度及固定化特性进行了研究。得到的固定化酶对10-7mol/L水平下的敌敌畏仍有明显的抑制响应，这一效果明显优于游离酶的抑制响应。

许学勤[25]研究了离子交换法得到的固定化小麦酯酶和固定化鸡肝酯酶的主要性质与相应的游离态酶的性质。结果表明，固定化小麦酯酶的最适pH在5.5附近，比游离小麦酯酶的最适pH增加了0.8个pH单位；固定化鸡肝酯酶的最适pH在8.0附近，比游离鸡肝酯酶的最适pH增加0.5个pH单位；固定化小麦酯酶的最适温度与游离酶的相当，但酶活力温度曲线的峰形变小；固定化鸡肝酯酶的最适温度比游离鸡肝酯酶下降了5 ℃，酶活力温度曲线的峰形也略变陡峭。这2种固定化酯酶对有机磷类农药(敌敌畏)抑制的响应明显高于游离酶对农药抑制的响应。

许娟[26]采用硝酸纤维素膜(NC)和植物酯酶研究了农药残留快速检测固定化酶片。通过对酶用量、戊二醛浓度、牛血清白蛋白浓度、固定化pH和温度的参数优化，建立了NC膜固定化植物酯酶的方法，即：20 μL游离酶，0.05%戊二醛2 μL，0.5%牛血清白蛋白15 μL，pH7.0缓冲液体系，4 ℃下固定8 h。对游离酶和固定化酶的特性进行了比较，发现固定化植物酯酶对底物的最适反应温度为35 ℃，比游离酶提高了5 ℃；最适pH为8.0，比游离酶提高了0.5个pH单位。游离酶和固定化酶对4种农药(敌敌畏、灭多威、氧乐果、久效磷)的敏感性进行比较，发现固定化酶对4种农药敏感性都较游离酶有所提高，固定化酶更适合于农药的快速检测。

马文石[27]等以聚乙烯醇(PVA)与四乙氧基硅烷(TEOS)为原料，通过原位溶胶-凝胶法制备了PVA/SiO2有机无机杂化溶胶，并将显色剂和植物酯酶分散于溶胶中干燥成膜，得到一类多孔性和亲水亲丙酮性可调的杂化膜。用扫描电镜(SEM)和衰减全反射红外光谱(ATR)对膜的断面形貌和表面化学基团进行了观察和表征；研究膜的亲水亲丙酮、耐水耐丙酮性能以及显色与响应性能。结果表明：膜的多孔性、亲水亲丙酮性能可通过膜中植物酯酶、显色剂的含量来调控；在乙酸-α-萘酯溶液中，该膜在可见光520 nm处出现一个新的吸收峰，且当测试液中乙酸-α-萘酯的质量百分数为20%时，膜的响应时间为12 min、透光率为1.72%。

固定化酶与水溶性酶(游离态)相比：酶的使用效率提高；酶的反应过程可以严格控制；但固定化酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本；与完整细胞比较，不适用于多酶系的测定，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离纯化后，才能进行固定。

4 检测方法

目前用酶抑制法测定农药残留时，根据所选用酶的种类不同，可以采用不同的底物进行反应，对分解产物测定常用的方法有光度法和生物传感器法等。

4.1 酶抑制光度法

酶的存在的状态可以分为游离态的酶和固定化酶，应用光度法分析时多采用酶溶液(游离态)，目前应用这种方法检测有机磷及氨基甲酸酯类农药较多，作者们探讨了酶抑制法的检测范围，论证了在检测时加入表面活性剂的显著效果。

陈帆[28]将植物酯酶水解2,6-二氯靛酚乙酯产生的光密度的变化这一特性应用于毒死蜱的检测。通过正交实验，找出了最优的反应条件。应用此法可半定量检测出在0.05～0.09 mg/L浓度范围内的毒死蜱。

钟树明等[29,30]应用植物酯酶抑制技术测定有机磷农药时，用植物酯酶水解橙色的2,6-二氯靛酚乙酯，用光度法在605 nm处测定分解的靛酚(蓝色)光密度，测定有机磷的含量。2,6-二氯靛酚乙酯既是底物又具有显色剂的功能，相对于乙酸-1-萘酯为底物，固蓝B盐为显色剂的反应体系，该方法既简便又准确。常用的几种有机磷及氨基甲酸酯类农药的测定限在0.001 5～0.330 0 mg/L范围内。

赵永福[31]等在所测试的5种表面活性剂(OP、CTMAB、CPC、SLS及SDS)中,阴离子表面活性剂、十二烷基硫酸钠(SDS)对被植物酯酶催化的显色反应呈现显著的增加灵敏度和稳定性的作用，同时还使显色剂的保存时间得以延长。

董超[32]采用植物酯酶抑制法进行有机磷农药的测定，实验过程中作者在传统酶法测定农药残留用的乙酸萘酯和固蓝B盐组成的液体显色剂的基础上按一定的比例与添加剂混合处理，配制成固体显色剂，从而把显色剂的有效使用期限延长到了3个月。

王继军[33]等选用聚苯乙烯微孔反应板作为酶的载体，将自制的植物酯酶固定在载体上的微孔内壁表面，制成农药快速检测板。采用酶抑制显色方法，检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，其检测灵敏度在0.01～0.1 mg/kg范围。该农药快速检测板为现场检测这两类农药提供了简便而快捷的方法。

宋茹等[34]在以黄瓜、小白菜为主要试验材料，利用有机磷、氨基甲酸酯类农药能够抑制乙酰胆碱酯酶活性的毒理机制，研制了一种简易快速，可定性及半定量测定蔬菜中常用的有机磷、氨基甲酸酯类农药残留的酶片快速检测法测定了敌敌畏、辛硫磷、甲基对硫磷的检出限为0.5 mg/kg、甲胺磷的0.01 mg/kg、克百威为0.84 mg/kg、灭多威为0.89 mg/kg。

于基成[35]等根据酶抑制法的原理，采用含1% BSA-GA(1∶1)0.1 mol/L pH 6.2的磷酸缓冲液将酶粗提液稀释1倍于37 ℃下固定24 h, 建立了以聚苯乙烯反应板为反应载体的农药(有机磷)快速检测方法，其最小检出量为0.245 μg(远低于有机磷农药韩国残留限量的标准)。

韩承辉等[10,36,37]研制了一种酶片，在适宜的温度与酸度条件下，用酶片与底物液2,6-二氯靛酚乙酯反应，根据反应前后颜色的变化判断农药的残留量，对常用几种有机磷农药其检测限在0.06～10.0 mg/kg范围。这种酶片具有价格低、易获取、稳定性好等特点，适用于田间、农贸市场和家庭在无仪器设备条件下检测有机磷农药的危险水平。研究表明，固定化酶不仅稳定性比游离态酶提高，而且检测的灵敏度也有所提高。

总之，光度法中存在的问题是: 植物酯酶在使用中干扰较多，专一性较差，检测所需的分光光度计与恒温箱不易携带，并且绿色植物的提取液对测定有干扰。

4.2 生物传感器检测法

生物传感器法是独立于酶抑制光度法的一种检测方法，它通常是指由一种生物敏感部件—传感器对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和反应的分析装置。传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间(酶与底物、抗体与抗原、外源凝集素与糖、核酸与互补片段之间)的识别反应会产生一些物理化学信号(如光热、声音、颜色、电化学)的变化, 这些变化通过不同原理的转换器(如光敏管压电装置、光极光敏电阻、离子选择性电极等)转换成第二信号(通常为电信号) , 经放大后显示或记录, 按生物功能区分生物传感器包括酶传感器、组织传感器和微生物传感器。

栾崇林等[38]采用研究溶胶凝胶法包埋植物酯酶的方法，制备有机磷传感膜，将该传感膜与光纤等器件耦合成有机磷光纤生物传感器，用于检测7种有机磷农药观察发现，有机磷农药浓度在0.010～10.000 μg/mL浓度范围内，抑制率与农药浓度的对数值呈良好线性关系，样品加标回收率在90.8%～96.3%，测定值的相对标准偏差小于5%。

马文石等[39]采用聚乙烯醇(PVA)与四乙氧基硅烷(TEOS)通过原位溶胶-凝胶法制备了PVA/SiO2有机/无机杂化溶胶，并将显色剂和植物酯酶分散于溶胶中，干燥成膜，得到一类透明度高、亲水-亲丙酮性可调、贮存性好的传感膜。该传感膜在乙酸-α-萘酯溶液中，于可见光520 nm处出现一个新的吸收峰。传感膜在制备后的12 d内活性明显下降，之后基本保持稳定，并且冷藏活性下降率要比室温保存小很多。但不论是冷藏还是在室温下保存，被固定在杂化膜中的酶的活性稳定性都比在溶液状态下明显提高。

综上所述，固定化酶主要有以下特性发生变化：(1)稳定性。固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好，主要表现在对热、蛋白酶、各种变性剂的耐受性增强，使用和保存的稳定性提高；(2)最适温度。固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但也有些固定化酶的最适温度与游离酶比较有明显的差别。例如，氨基酸酰化酶最适温度一般在60 ℃左右，用DEAE-纤维素固定化后，其最适温度高达72 ℃；(3)最适pH。酶固定化后，其最适pH往往会发生变化，这一点在使用时应引起注意。影响固定化酶最适pH因素主要有2个：一个是载体的带电性质；另一个是酶催化反应的产物性质；载体的带电性质对固定化酶的最适pH也有明显的影响。一般说来，带负电的载体制备固定化酶，其最适pH比游离酶高；而带正电的载体制备的固定化酶其最适pH比游离酶低；而用电中性的载体制备的固定化酶，其最适pH一般不改变。酶催化反应的产物性质对固定化酶的最适pH也有一定的影响。一般来说，产物为酸性时固定化酶的最适pH比游离酶高一些；产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低一些，产物为中性时，最适pH一般不改变。(4)底物特异性。固定化酶的底物特异性与游离酶比较有所不同。比如对一些可作用于大分子底物，也可作用于小分子底物的酶而言，经固定化后，由于受到载体空间位阻作用的影响，大分子底物难于接近酶分子，而使其催化反应速度大大降低，而小分子底物的反应速度则不受影响。

5 讨论与展望

植物酯酶作为农药残留检测用3种主要酶生物识别元件之一，来源广泛，取材方便，价格便宜，具有广阔的开发应用前景，然而其作为一种生物活性物质，植物酯酶极易失活或变性，同时不同植物酯酶对不同农药品种的抑制强度不同；现将应用植物酯酶存在的问题及后面可能的研究重点总结如下：

(1)目前对酶的研究大多集中在对酯酶的应用温度、pH、浓度及保存等方面的探索，但植物体属于一个庞大复杂的体系，是否需要对酶的提取和净化工艺的研究有所倚重，尽可能避免杂质在分析过程中带来的干扰效应，影响检测的灵敏度。

(2)酶的检测方法主要集中在物理和化学方面，其中物理方面是传统的比色法既分光光度法，用此方法检测农药残留时，一般酶提取液来自植物体，但所制酶液保存期短，而且底物和显色剂分别为乙酸萘酯和固蓝B盐溶液，两者混合成的显色基质溶液不稳定，需现用现配[40]；同时由于基质效应的存在，它一般在很大程度上影响分析，还有在此分析过程中酶的使用寿命的问题；经过众多学者的研究，人们发现如果把酶固定(化学检测方法)在试纸上或其它化学物质上，酶的活性比以前提高了，使用活力由过去游离态的现配现用到现在的固定态保存3个月甚至更长的时间，随着研究的深入，研究者发现酶经固定后，其结构和性质会发生相应的变化，然而如何克服该种现象的发生还值得深思。

(3)植物酯酶凭借其在自然界的众多优势，正逐渐被人们所接纳，然而如何研制出更稳定的、有效期更长的、对不同品种农药检测更新颖的方法，是迫待解决的问题。

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