脂蛋白相关磷脂酶A2表达载体的构建

杲修杰，刘晓华，钱令嘉

(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)

脂蛋白相关磷脂酶A2表达载体的构建

杲修杰，刘晓华，钱令嘉

(军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)

为构建大鼠脂蛋白相关磷脂酶A2(LP-PLA2)原核表达载体，采用PCR方法扩增得到了大鼠LP-PLA2基因全长序列，构建了pGEX-4T-1-rLP-PLA2重组质粒。将该质粒进行DNA序列测定，结果与LP-PLA2序列一致。成功构建的LP-PLA2的原核表达载体pGEX-4T-1-rLP-PLA2可用于LP-PLA2的功能研究，为研究LP-PLA2在细胞中的功能奠定了基础。

动脉粥样硬化；LP-PLA2；pGEX-4T-1；载体构建

近年来，在对动脉粥样硬化病因机制的探寻中，众多研究结果显示脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2)与动脉粥样硬化具有相关性，LP-PLA2可能作为一种炎症反应标志物，在动脉粥样硬化的启动和发展中起关键作用[1～3]。为了更为深入地研究血浆LP-PLA2在动脉粥样硬化发生中的作用和生物学意义，本研究通过PCR技术扩增LP-PLA2基因并成功构建了LP-PLA2的原核表达载体pGEX-4T-1-rLP-PLA2，为LP-PLA2的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

pGEX-4T-1质粒购自GE公司；BamH I 、XhoI、Taq DNA聚合酶、T4-DNA连接酶、DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、2×pfu PCR MasterMix、E.coliDH5α菌株购自北京天为时代公司产品；其余均为国产分析纯试剂。核酸电泳单元及附件为Bio-Rad公司产品；PCR仪购自PE公司。

1.2 重组质粒的构建

(1) LP-PLA2基因片段的扩增及回收 根据Genbank所查到的LP-PLA2基因设计扩增引物，并由博亚生物公司合成。上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGCCGCTCAAACTGC-3’(插入BamH I酶切位点)。下游引物：5’-CCGCTCGAGCTAATTCTGGTTGTGTGAT-3’(插入XhoI酶切位点)。大鼠肝脏组织用Trizol法提取RNA，逆转录获得cDNA作为PCR的模板。PCR反应条件：94 ℃预处理5 min, 94 ℃变性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 30个循环后，72 ℃再延伸10 min。PCR产物回收：PCR产物15 μL/孔进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下切除含目的DNA片段的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段。

(2)质粒和目的DNA基因片段的酶切 在1 mL Ependorf管中加入下列反应体系：1 μLBamH I,1 μL XhoI,2 μL 10×buffer, 10 μLLP-PLA2基因片段，6 μL 去离子水。放入37 ℃水浴中1 h以上，置于4 ℃冰箱中备用。

(3)DNA片段回收 酶切产物15 μL/孔进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下切下所需的DNA片段，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA片段，并放入-20 ℃备用。

(4)连接反应 在1 mL Ependorf管中加入下列反应体系：1 μL T4-DNA连接酶,2.5 μL T4-DNA连接酶 10×Buffer,1 μL载体DNA, 1.5 μLLP-PLA2基因片段，19 μL 去离子水。放入16 ℃水浴中10 h以上，置于4 ℃冰箱中备用。

(5)转化反应 将装有感受态细菌的Ependorf管置于冰上融化。取10 μL目的DNA加入到100 μLE.coliDH5α感受态细菌中，轻轻旋转以混匀内容物，冰浴放置30 min。将Ependorf管放于42 ℃水浴中90 s后，转移到冰浴中，冷却3 min。加入500 μL液体LB培养基，置于37 ℃摇床振摇培养，温育45 min使细菌复苏。取100 μL已转化的感受态细菌转移到含相应抗生素的LB固体培养基上划板，置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37 ℃培养12～16 h，挑选单一的菌落扩增培养。

(6)酶切鉴定 用质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒送到博亚公司鉴定。

2 实验结果

2.1 构建载体pGEX-4T-1-rLP-PLA2

脂蛋白相关磷脂酶A2基因编码序列全长为1 323 bp。以大鼠cDNA为模板，采用PCR方法扩增脂蛋白相关磷脂酶A2基因全长序列，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，在 1 000～2 000 bp处有1条明亮条带(图1)。

将脂蛋白相关磷脂酶A2基因PCR产物和pGEX-4T-1质粒经过BamH I/XhoI酶切、连接、转化、筛选后，获得pGEX-4T-1-rLP-PLA2质粒。将此质粒用BamH I/XhoI酶切，凝胶电泳可见2条清晰的条带，从大小上分别与pGEX-4T-1载体片段和脂蛋白相关磷脂酶A2编码基因序列长度一致(图2)。

图1 LP⁃PLA2基因PCR扩增结果Figure1 PCRresultsofLP⁃PLA2gene图2 pGEX⁃4T⁃1⁃rLP⁃PLA2质粒酶切结果Figure2 DoublerestrictionenzymedigestofpGEX⁃4T⁃1⁃rLP⁃PLA2plasmid

将此质粒送至博亚公司测序，测序结果如图3所示。经NCBI Blast比较，该序列与NM_005084脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的cDNA编码序列完全一致，表明载体pGEX-4T-1-rLP-PLA2构建成功。

图3 pGEX-4T-1-rLP-PLA2质粒测序结果Figure 3 Results of sequencing pGEX-4T-1-rLP-PLA2 plasmid

3 讨论

近年来的多项国际研究结果确认了血浆水平与心血管疾病相关性，LP-PLA2水平对心血管细胞生物学效应的研究正引起越来越多的关注[4～7]。研究发现LP-PLA2能够引起内皮功能障碍，启动和促进多种炎性反应，从而导致动脉粥样硬化的形成[8]。血浆LP-PLA2参与了心血管疾病发生发展的病理机制，血浆中LP-PLA2水平的变化可能标志着心血管疾病的病程[4]。本实验以大鼠cDNA为模板，通过PCR的方法得到了脂蛋白相关磷脂酶A2的基因序列，并将其与pGEX-4T-1质粒进行酶切和连接，得到了pGEX-4T-1- rLP-PLA2载体，经酶切和测序鉴定，所得到的载体即为我们所需要的pGEX-4T-1-rLP-PLA2载体。该载体的构建为LP-PLA2的功能研究提供了很好的保证，为以后研究LP-PLA2在多种疾病的病理过程中发挥的生物学作用及其分子基础提供了实验基础。

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2009-03-20

天津市应用基础研究计划面上项目(07JCYBJC08900)

杲修杰(1980-) ,男,山东潍坊人，理学硕士，研究实习员，主要从事应激医学研究.

钱令嘉, newjia@vip.sina. com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.012

Q782

A

1673-1409(2009)03-S039-03