草坪草褐斑病菌次生代谢物的生物活性测定

孙淑琴　刘水芳　杨秀荣

摘要:以病原菌的致病因子为出发点,对病原菌次生代谢物的生物活性进行了测定。研究结果表明,立枯丝核菌的代谢产物能引起与病原相似的病斑,并且毒害作用大小与其致病力存在一定相关性。代谢产物对胚根伸长、胚芽生长均造成一定影响,抑制作用可分别达到42.06%~91.20%、2.31%~18.79%,但对种子发芽率无太大影响。

关键词:草坪褐斑病;次生代谢物;生物活性

中图分类号:S432.1文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0075-03

Bioactivity Assay of Secondary Metabolites of Rhizoctonia solani

SUN Shu-qin,LIU Shui-fang,YANG Xiu-rong

(Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin300112,China)

Abstract:In this paper, the bioactivity of secondary metabolites that was the pathogenic factor of brown patch disease probably was assayed. The results showed that disease spots that caused by metabolites was similar to that of pathogen and the pathogenicity and the toxicity effect had some correlations. Secondary metabolites had not great influence on the germination rate but had some influence on the growth of radicle and embryo, the inhibition effect was 42.06%~91.20% and 2.31%~18.79%, respectively.

Key words: brown patch disease;secondary metabolites;bioactivity

草坪褐斑病(Brown Patch Disease)又称夏枯病或立枯丝核疫病,是报道最早、分布最广的草坪草病害之一。受害草坪在发病条件适合时,短时间内可发展成2 m左右的枯草斑,极大地影响草坪的观赏价值和使用价值,造成巨大的经济损失。

草坪褐斑病病原主要是丝核菌属的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。研究表明,立枯丝核菌菌株的代谢产物与其对寄主的致病能力存在显著正相关,说明代谢产物在病原菌的致病过程中起重要作用。本研究对草坪草褐斑病病原菌的代谢产物进行了生物活性测定,以明确代谢物在致病过程中的作用,并为病害的防治提供可靠的理论基础和科学依据。

1材料和方法

1.1立枯丝核菌致病性测定

采用喷雾接种法,把采自天津市的20份褐斑病病原立枯丝核菌接种到修剪后的盆栽高羊茅叶片上。接种后覆膜保湿24 h,一周后调查病害发生情况,筛选强、弱致病力菌株。

1.2立枯丝核菌代谢产物的生物活性测定

1.2.1代谢产物的制备将菌株R.H2、R.S1在PDA上扩大培养后,用直径0.5 cm打孔器在菌落边缘打孔,挑5块菌丝块接种于150 mL PS培养液中,25 ℃静置培养15 d。培养液2层滤纸过滤后备用。

1.2.2代谢产物对离体叶片的致病性在培养皿中先铺2层滤纸,加入10 mL无菌水,再在滤纸上置2个载玻片,将高羊茅叶片置载玻片上。用微量注射器针刺高羊茅叶片造成伤口,在伤口处分别放直径0.5 cm的菌盘和20 μL代谢液,以蒸馏水为对照,置室温培养。3 d后观察伤口处症状。

1.2.3代谢产物对高羊茅胚根、胚芽生长的抑制作用用55～60 ℃温水浸泡高羊茅种子,表面消毒2 h,再用丝核菌代谢产物浸泡6 h,纱布包好后置培养箱中催芽3 d。挑取一致的种芽测量胚根、胚芽长度后,放入铺有2层滤纸含10 mL代谢液的培养皿中,每皿20粒,以含10 mL水的培养皿为对照,每处理3次重复。25 ℃培养3 d后测量胚根、胚芽长度,计算净增量和抑制率。

1.2.4代谢产物对高羊茅种子发芽率的影响将病原菌代谢液10 mL注入铺有2层滤纸的培养皿中,每皿放入100粒高羊茅种子,设含10 mL水的培养皿为对照,每处理3次重复。3 d后检测种子的发芽率。

2结果与分析

2.1立枯丝核菌致病性测定

叶片发病后按以下标准调查叶片病情指数。0级:无病斑;1级:病斑面积占叶面积的10%以下;2级:病斑面积占叶面积的10%～25%;3级:病斑面积占叶面积的26%～50%;4级:病斑面积占叶面积的51%～70%;5级:病斑面积占叶面积的71%以上。

调查结果表明,接种的20份褐斑病病原均可引起高羊茅发病,但发病程度不同,病情指数在18%～76%。选取高病情指数即强致病力菌株R.H2和低病情指数即弱致病力菌株R.S1作为目标菌。

2.2立枯丝核菌代谢产物的生物活性测定

2.2.1代谢产物对离体叶片的致病性针刺叶片分别接种丝核菌R.H2和R.S1的菌盘、代谢液,结果表明,立枯丝核菌代谢产物可在一定程度上引起高羊茅叶片产生褐斑病病斑,但发病程度不同:R.H2菌盘>R.H2代谢液>R.S1菌盘>R.S1代谢液。病斑褪绿,呈圆形、椭圆形至不规则形,颜色为褐色。对照处理在针刺点处只有极小的枯死圈,而无病斑和褪绿斑。据此可以推测丝核菌代谢产物中含有对叶片有一定的毒害作用的物质,病原菌浸染草坪草后,病斑的形成可能与其有关。并且代谢物的毒害作用大小与病原菌的致病力强弱有一定的相关性。

2.2.2代谢产物对高羊茅胚根、胚芽生长的抑制作用研究结果表明(表1、表2),强致病力菌株R.H2处理的胚根根尖生长点变褐,伸长受到很大的抑制,3 d内由处理前的23 mm增长为处理后的23.9 mm,生长抑制率达91.20%,而胚芽伸长受到的影响较小,抑制率为18.79%。弱致病力菌株R.S1处理后,根尖颜色无变化,生长受到较小抑制,由处理前的17.4 mm增长为处理后的23.3 mm,生长抑制率为42.06%,胚芽生长抑制率仅为2.31%。经SSR方差分析结果显示,菌株R.H2与R.S1代谢产物对胚根、胚芽的毒害作用大小均存在显著差异。

2.2.3代谢产物对高羊茅种子发芽率的影响不同处理的种子发芽率测试表明,各处理对种子发芽率无太大影响且各处理间差距不大,说明丝核菌代谢产物对种子发芽率无明显影响。

3讨 论

本试验初步研究了草坪草褐斑病病原立枯丝核菌的次生代谢物的生物活性,结果表明,代谢物能引起与病原相似的病斑,并对高羊茅种子胚根、胚芽的伸长造成影响,而对种子的发芽率无影响,并且强致病力菌株R.H2与弱致病力菌株R.S1的代谢产物对离体叶片的致病作用、对胚根和胚芽的毒害作用均有明显的差异,表明草坪草褐斑病的代谢产物的毒害作用大小可能与其致病性存在相关性。这些结果均与有关报道一致。

近几十年的研究成果表明,植物病原物产生的对寄主植物有害的代谢产物主要有酶、毒素和激素等。很多研究认为,病菌代谢产物的多少及其活力大小影响其致病力强弱。国内外对草坪草褐斑病已做了大量研究,但有关病原菌代谢产物的报道很少,多见于同属的病原菌。Sriram等提出水稻纹枯病病原立枯丝核菌的致病性与产生的毒素有关。徐艳等研究表明水稻纹枯病病原立枯丝核菌能产生毒素,并且毒素在病菌致病过程中起重要作用。张华东等研究表明水稻纹枯病病原立枯丝核菌菌株的产毒能力与其对水稻植株的致病能力存在显著正相关,相关系数为0.825 5。徐敬友等在研究水稻纹枯病菌时认为,病原菌的致病因子有毒素和细胞壁降解酶2种因子,其中哪个因子更重要一些,有待进一步研究。Bateman等则认为果胶酶是立枯丝核菌的致病因子。

本研究的结果表明,草坪草褐斑病病原立枯丝核菌的代谢产物在在致病过程中发挥重要作用,至于代谢产物中发挥作用的物质是毒素还是细胞壁降解酶或果胶酶或是两者共同作用,正在进一步研究中。

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