不同消毒处理对竹芋组培无菌外植体获得的影响

夏时云　付任胜　张德岚　马武赟

摘要:以过渡栽培植株的侧芽或顶芽为外植体,研究了不同消毒处理对竹芋组培无菌外植体获得的影响。结果表明:采用抗菌素浸泡5 h、熏蒸12 min并配合常规消毒处理(75%酒精浸泡1 min;3.0%～5.0%的次氯酸钠和0.1%升汞1∶1混合溶液浸泡10～12 min)对外植体进行综合灭菌,能较快地杀灭竹芋外植体表面细菌,使初次接种污染率控制在20%以下。

关键词:竹芋;组织培养;消毒处理;污染率;外植体

中图分类号:S682.1+61文献标识码:A文章编号:1006-6500(2009)02-0006-03

Effect of Different Disinfection Treatment on Sterile Explant Obtaining in Tissue Culture of Calathea spp

XIA Shi-yun1,FU Ren-sheng1,ZHANG De-lan2,MA Wu-yun2

(1.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300192,China;2.Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384,China)

Abstract:The effect of different disinfection methods on explant obtaining in Calathea spp was studied. The results showed that pre-treatment and antibiotic marinating for 5 h and suffocating for 12 min as well as ordinary disinfection for 12 min for surface disinfection could effectively control explant contamination. The contaminate rate with this method would be less than 20%.

Key words: Calathea spp;tissue culture;disinfection treatment;contaminate rate;explant

竹芋(Calathea spp)是目前比较流行的多年生观叶常绿草本植物,市场需求一直呈递增趋势。目前,国内大多竹芋品种是从国外引进的。竹芋一般分蘗较少,用常规分株繁殖难以扩大生产,因此,研究竹芋组培快繁技术体系具有重要意义。

竹芋植物的芽大部分位于栽培基质内,且地下部分有较发达的通气组织,组织内部有大量的寄生或内生菌,在竹芋组培中,采用常规的酒精、HgCl2等溶液灭菌,只能杀死表面的细菌,无法渗入外植体内部,不能彻底杀灭组织材料的内生菌,在初代培养和增殖过程中易出现严重的细菌污染[1],如培养基表面出现多色的水渍样,有些底部呈现白色晕状;有时也出现真菌污染,如培养基表面出现各种霉菌,严重影响组培苗的正常生长,甚至导致死亡[1-7]。笔者以过渡栽培植株的侧芽或顶芽为外植体,采用抗菌素浸泡、熏蒸并配合常规消毒处理对外植体进行综合灭菌,能较快地杀灭竹芋外植体表面细菌;在诱导培养基中适量添加生物杀菌剂,能较大幅度地降低外植体的污染率,取得较理想效果。

1材料和方法

1.1材 料

市购盆栽“双线竹芋”、“青苹果”竹芋,购回后挖出,洗净基质并消毒处理,无土栽培2～3个月,每隔1周喷洒1次500倍多菌灵溶液,取植株萌动的顶芽和侧芽作试验材料。

1.2方 法

1.2.1预处理将外植体先用洗衣粉水浸泡30 min,自来水冲洗30 min。

1.2.2抗菌素浸泡在500～800倍多菌灵溶液中分别浸泡2,3,4,5,6 h,自来水冲洗干净。设未浸泡的为CK1。

1.2.3熏蒸将预处理与抗菌素浸泡后的外植体在密封玻璃容器中,用高锰酸钾∶甲醛=1∶2 熏蒸5,10,15,20 min后备用。设未熏蒸为CK2。

1.2.4常规消毒处理超净台上,用75%酒精浸泡1 min;在3.0%～5.0%次氯酸钠∶0.1%升汞=1∶1混合溶液中分别浸泡8,10,12,15 min,无菌水冲洗5～6次。

1.3 培养条件

取已消毒的外植体,剥离茎尖接种于适量添加生物杀菌剂的诱导培养基内。温度(25±2)℃,光照强度2 000～2 500 lx,光照周期14 h/d。10 d后观察污染情况。

2结果与分析

2.1不同抗菌素浸泡时间对竹芋初代培养外植体污染率的影响

将预处理后的外植体用抗菌素不同时间浸泡并熏蒸15 min、常规消毒15 min处理(见材料和方法,下同),无菌水冲洗后的外植体接种在培养基中,培养10 d后,调查外植体污染情况。从表1可见:(1)经不同时间抗菌素浸泡后,初代培养外植体的污染率显著不同,并随浸泡时间延长而降低,污染率在12.0%～84.0%,而未经浸泡的高达96.7%;(2)在浸泡处理中,以抗菌素浸泡5 h的效果好,污染率只有18.1%;(3)本试验中,虽然抗菌素浸泡6 h能获得更低的污染率(12.0%),但我们发现,浸泡6 h后,初代培养时受到抑制,茎尖几乎停止生长,对竹芋诱导培养极为不利。

本试验只用了较高浓度的多菌灵浸泡处理,取得了较好的效果。但其它抗菌素如代森锰锌、百菌清及链霉素、庆大霉素等是否有效,以及配合使用的协同效果,需进一步试验。

2.2不同熏蒸时间对竹芋初代培养外植体污染率的影响

将预处理后的外植体先用抗菌素浸泡5 h,再进行不同时间熏蒸处理,最后常规消毒15 min,无菌水冲洗的外植体接种在培养基中,培养10 d后,调查污染情况。从表2可见,经不同时间的熏蒸处理,初代培养的外植体污染率为23.5%～77.2%,随熏蒸时间延长而降低。在不同处理中,以熏蒸15 min的效果最好,污染率为26.2%,比对照降低53.5个百分点。熏蒸20 min能获得更低的污染率(23.5%),但初代培养时茎尖灰白,生长不良。因此,熏蒸时间不宜过长,时间过长对熏蒸的外植体杀伤力太大。可采取熏蒸12～15 min,再结合其他灭菌处理,可以取得较理想的效果。

2.3不同时间常规消毒对竹芋初代培养外植体污染率的影响

外植体经预处理和抗菌素浸泡5 h及熏蒸12 min后,在超净台上进行不同时间的常规消毒处理,无菌水冲洗后接种在培养基中,培养10 d后的外植体污染率见表3。从表3可见,常规消毒时间不同,初代培养的外植体污染率也不同,并随常规消毒时间延长而降低,污染率在14.6%～48.7%。表明常规消毒对竹芋外植体消毒灭菌有很好的效果。在常规消毒中,以消毒10～12 min 较好,污染率为31.1%～32.9%。处理15 min容易使初代培养的茎尖死亡。

3结 论

植物组织培养过程中,外植体消毒处理难,易出现污染是最常见的问题[2-7]。从以前所报道的试验结果来看,在竹芋外植体消毒灭菌方法中,大多数研究者只提供了1种或2种表面灭菌的方法,且还只停留在实验室阶段[1]。我们以过渡栽培植株的侧芽或顶芽为外植体,研究了不同消毒处理对竹芋组培无菌外植体获得的影响。结果表明:采用抗菌素浸泡5 h、熏蒸12 min、常规消毒处理10～12 min对外植体进行综合灭菌,能较快地杀灭竹芋外植体表面细菌。在诱导培养基中适量添加生物杀菌剂,能较大幅度地降低外植体的污染率,使初次接种污染率控制在20%以下,为今后竹芋工厂化组培快繁中的污染问题提供了一种有效的克服方法。这些方法在其他植物的组培苗工厂化生产中,也有较好的借鉴意义和应用前景。在生产上应对外植体进行彻底灭菌和严格的无菌操作,避免出现污染,尽可能多地获得无菌外植体,为建立起竹芋初次培养无菌体系奠定基础。

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