松木层孔菌粗多糖提取工艺的研究

吴恒梅　李秀霞　张丽萍

【摘要】对松木层孔菌发酵菌丝体多糖的提取工艺进行了研究,通过单因素试验和正交试验L9(33),研究了提取次数、浸液比和提取时间对多糖提取率的影响,结果显示提取次数、浸液比和提取时间是影响多糖提取率的主要因素,最佳工艺为提取温度常温,提取3次,每次浸液比(质量比)1:30,时间是1 h。各因素影响大小的次序是:提取次数>浸液比>提取时间。

【关键词】松木层孔菌 可溶性多糖 提取工艺

Study on the Extraction Technology of Polysaccharide

from Phellinus linteus

Wu Heng-mei1,Li Xiu-xia1,Zhang Li-ping2

(1 College of Life Science;Jiamusi University;China; Jiamusi 154007;2 School of Life Sciences,Northeast Normal University, Changchun130024, China)

【Abstract】 The extraction of polysaccharides from the fermentative mycelium of Phellinus pini was studied. Single factor test and orthogonal experiment design method L9(33) were applied to analyze the influence of factors such as the concentration of alkali, extract times,solid-liquid ratio,and time on the extraction percent of the polysaccharides. Experimental results indicated that extract times, solid-liquid ratio and time significantly affect the extraction percent of the soluble polysaccharides.The optimum condition was the normal temperature, extraction three times and the diffusion ratio 1:30 and the extraction time was one hour.The sequence of each influence factors is: extraction times>extraction ration> time.

【Key words 】Phellinus pini;soluble polysaccharide; extraction technology

引言

多糖(Polysaccharide)是由许多相同或不同的单糖通过糖苷键连接而成的化合物,其分子量一般为数万甚至数百万[1]。多糖具有免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、降血糖血脂、利尿和抗溃疡等生物活性作用。松木层孔菌又名为松针层孔菌、松白腐菌(Phellinus pini),隶属于担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、多孔菌科 、层孔菌属。

王稳航[2]首次从松木层孔菌子实体提取多糖进行了抗氧化性研究。结果表明,多糖抗氧化效果较好,对超氧阴离子自由基的清除率均达到90 %以上,丙二醛生成抑制率均达到65%左右。目前从松木层孔菌中提取粗多糖工艺的研究还鲜见报道,近年来对多糖提取工艺的研究方法较多[3,4-6],如热水提取法、稀碱液提取法、稀酸液提取法,本文采用稀碱液提取法。通过对发酵菌丝体水溶性多糖碱提工艺的研究,以其获得一种松木层孔菌发酵菌丝体多糖提取率较高的工艺,获得最优化的工艺参数,希望为工业化生产研究有所帮助。

1. 材料和方法

1.1 材料

松木针层孔菌 (Phellinus pini.) 菌丝体的获得:松木层孔菌子实体采自长白山,从松木层孔菌子实体中分离菌种,取活化后的斜面母种接入500 ml锥形瓶中,28℃,140 r·min-1培养7 d,发酵结束后,4000 rpm 离心收集新鲜菌丝体,烘干备用。

1.2 方法

1.2.1 粗多糖的提取与分离(以去除水提水溶多糖[8]的菌丝体残渣为材料)

经水提的菌丝体残渣,烘箱干燥,称取5克干燥的松木层孔菌菌丝体,然后加入0.5 mol/LNaOH 溶液,在一定温度下进行一定时间的提取,反复提取3次,合并提取液经过过滤,加 Hcl 中和,在水浴锅中浓缩至小体积,得浓缩液,透析,用3倍体积97%(质量分数)乙醇醇析得水溶性粗多糖沉淀,低速离心机离心,转速3500转,离心10分钟,弃去上清液,沉淀用无水乙醚洗涤2次,真空干燥后,得碱提水溶性粗多糖的产品。

1.2.2 多糖含量的测定(苯酚-硫酸法)

本实验先用标准葡萄糖溶液在490nm处的吸光度处制标准曲线。精确称取碱提水溶性多糖5 mg,定容至50 ml糖溶液,然后取干燥洁净试管,将0.1mg/ml糖溶液,6%的酚溶液,浓H2SO4依次按1:0.5:2.5的比例加入、振荡、摇匀、冷却、静止,每个样品平行做三管,蒸馏水作对照,然后在490 nm波长下比色,所得数值取平均值,查标准曲线可得总糖含量。

2. 结果和讨论

2.1 多糖含量的测定

在实验条件下,以浓度(C)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标作图,得标准曲线。

2.2 提取次数、浸液比和提取时间单因素对松木层孔菌可溶性多糖提取率的影响[7]

碱提涉及三个关键条件:提取次数、浸液比和提取时间。提取次数采用1次、2次、3次、4次、5次五个水平;浸液比(干燥样品的质量与水的质量之比)采用1:10、1:20,1:30、1:40和1:50五个水平,提取时间采用1h、2h、3h、4h和5h五个水平分别进行单因素试验。

2.2.1 提取次数的影响

不同的提取次数对水溶性多糖提取率的影响,提取次数的上升会增加碱提水溶性多糖的含量,在提取3次后多糖含量增加的幅度不大,趋于平缓。

2.2.2 浸液比的影响

不同的浸液比对水溶性多糖提取率影响。试验结果显示:浸液比的增加会使水溶性多糖的含量增加,随浸液比的增加,碱提水溶性多糖含量也逐渐增大,在浸液比1:30后,多糖含量增大幅度减小。

2.2.3 提取时间的影响

不同提取时间对水溶性多糖提取率的影响。试验结果表明:提取时间在0-2 h内,提取液中的多糖含量上升幅度较大,而2-4 h以后含量稍有上升。所以最佳提取时间为3 h。

2.3 碱提松木层孔菌中水溶性多糖提取率的正交试验

2.3.1 正交试验设计和结果分析[8]

以碱提水溶性多糖的含量为标准,选择影响提取菌丝体多糖产量的三个主要因素:提取时间、提取比(质量比)、提取次数,每个因素设3个水平,选用L9(33)正交试验,因素水平见表1、试验结果计算及分析见表2。

从表2可知,提取次数是影响水溶性多糖提取率的最关键因素,其次是提取时间,在实验范围内,浸液比的影响最小。

2.3.2 正交试验的方差分析结果

正交试验的方差分析结果如表3所示:提取次数的差异显著对松木层孔菌可溶性多糖提取率的影响起最主要作用,浸液比和提取时间在此实验范围内无显著性差异,对测定结果的影响不大。这与直观分析结果是相吻合的。

3.结论

在碱提松木层孔菌水溶性多糖过程中,提取次数为影响多糖率提取的最主要因素,各因素影响的大小次序是:提取次数>浸液比>提取时间。提取温度在常温下,确定菌丝体多糖的最佳提取工艺条件为:碱的浓度为0.5 mol/L,提取时间1 h,提取次数3次,浸液比(质量比)1:30。

参考文献

[1]倪福太.缝裂层孔菌发酵菌丝体多糖质量标准的确定[D].东北师范大学生命科学学院糖类生物化学,2007年.

[2]王稳航,李玉,刘安军.松木层孔菌多糖的提取及抗氧化性研究[J].食品研究与开发, 2006,27(11):53-55.

[3] 王 扬,王海洪等.羊栖菜多糖的提取和分离[J].宁波大学学报,2002,15(1):53-55.

[4] 贾建会、吕晓莲等.深层发酵羊肝菌多糖的提取、分离及纯化研究[J].食品科学,2002,23(4):59-62.

[5] 刘成梅,付佳明,等.百合多糖提取的影响因素研究[J].食品科学,2002,2(2):87-89.

[6] 李春喜、王志和、王文林编著.生物统计学(第二版)[M].北京:科学出版社,2002.

[7]史军花,梁忠岩等猴头发醉菌扮多糖的分离、提取、纯化及其初步研究[J].长春师范学院学报,2002,21(1):36-38.

[8] 李巧云,翟春,居红芳,葛粉凤. 棒蘑粗多糖提取工艺的研究[J].化学世界,2004,7:372.

作者简介:吴恒梅,江苏省睢宁人,佳木斯大学生命科学学院副教授,主要从事糖类生物化学研究。