植物类胡萝卜素研究进展

侯耀兵　康保珊　黄进勇

摘要：结合西瓜介绍植物中类胡萝卜素的结构、生物合成途径中的酶及基因、合成调控研究进展．提出目前研究存在的问题，并展望未来的研究方向。

关键词：西瓜；类胡萝卜素；基因；表达；调控

类胡萝卜素通常是指C40的碳氢化合物(胡萝卜素)和它们的氧化衍生物(叶黄素)2类色素的总称。它们在结构上由8个异戊二烯单位缩合而成，典型的C类胡萝卜索携带紫罗酮环。环上不同位置的氢原子可被羟基、羰基、环氧基取代。在植物中．类胡萝卜素担当叶绿体光合作用的辅助色素并保护叶绿素免受强光破坏。同时也是合成植物激素ABA的前体。除八氢番茄红素和六氢番茄红素外．绝大多数类胡萝卜素呈黄色、橙色或红色。约有10％的类胡萝卜素是维生素A的前体．是人和动物食物中重要的成分。研究表明．类胡萝卜素在医学保健方面有重要的作用。目前．对类胡萝卜素的需求量很大．通过化学合成与微生物发酵等获得的类胡萝卜素已经不能满足市场的需要。近年对其生物合成途径的研究取得了巨大的进展．关键基因先后得到分离．并初步实现通过基因工程来调控类胡萝卜素的合成。

西瓜作为重要的世界性水果．在我国栽培面积近150万hm2。西瓜有各种不同的瓤色，如黄色、橘黄色、粉红色、红色等，这是由于含有的类胡萝卜素种类和量不同。瓤色是西瓜的重要性状之一。其中类胡萝卜素更是决定其营养与品质的重要指标。提高或改变西瓜中类胡萝h素组成和含量．改良其品质已成为目前西瓜育种工作的重要课题。本文概述了类胡萝卜素生物合成途径中的酶和基因及表达调控方面的研究。尤其是在西瓜方面的研究进展。

1类胡萝卜素的生物合成途径及其相关酶的基因克隆

类胡萝h生物合成主要是先合成前体物异戊烯焦磷酸(IPP)，LPP和其异构体二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)缩合形成槛牛儿基焦磷酸．再与2个IPP在栊牛儿糖牛儿基焦磷酸合成酶(GGPs)催化下合成栊牛儿糖牛儿基焦磷酸(GGPP)，GGPP是植物多种物质生物合成的共同前体。然后2分子的GGPP由八氢番茄红素合成酶(PSY)催化形成无色的八氢番茄红素。后者在PDS和ZDS的作用下形成红色的番茄红素。番茄红素经LCYB和LCYE催化环化，形成2个B环的B-胡萝卜素和a-胡萝卜素(1个B和1个8环)，这是类胡萝卜素合成途径中的关键分支点。a-胡萝卜素通过连续的羟基化反应形成叶黄素。B-胡萝卜素羟基化反应形成玉米黄素。再经玉米黄素环氧酶催化形成堇菜黄素。

1．1IPP异构酶

Blanc和PicherskvH首先从Clarkia Brewer中克隆了IPP异构酶(IPPI)的eDNA。IPPI催化IPP形成DMAPP。目前在辣椒、水仙、拟南芥、莴苣等植物中得到分离鉴定．在拟南芥中发现2个IPPI。在大肠杆菌中．IPPI的活性受类异戊二烯合成产物的限制。导入植物、藻类或真菌IPPI eDNA都能成倍提高类胡萝卜素含量．推测IPPI也可能是植物类胡萝h素合成的限制因素。

1．2栊牛儿犍牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)

GGPS是萜类物质合成的一个重要分支点酶。该酶基因已从白羽扇豆、长春花和自芥中得到分离．其eDNA长1．1—1．4 kb，编码316-366个氨基酸。本组从西瓜中克隆得到508bp的GGPS eDNA片段，编码169个氨基酸序列，Blast比对后发现，与其他植物GGPS氨基酸序列同源性在85％以上。

1．3八氢番茄红素合成酶(PSY)

PSY是类胡萝卜素合成途径重要的限速酶．其基因早期是从番茄中获得的。现已从辣椒、拟南芥、玉米、黄水仙、甜瓜和白芥等植物中分离出PSY。在番茄、烟草、玉米和水稻等植物中有2个PSY基因．即PSY1与PSY2。PSYl和PSY2分别催化番茄果实和叶组织中八氢番茄红素的合成。目前已鉴别了PSY基因家族的3个成员，PSY-A，PSY-B与PSY-C。其中PSY-A和PSY-C有很高的同源性．PSY-C和甜瓜PSY的同源性高达96％。和番茄PSYl也有非常高的同一性。系统发育分析表明。西瓜的PSY-A和胡萝卜PSY亲缘关系近．而西瓜PSY-A和PSY-B的同源性只有54％．转录行为也明显不同。目前本组已从西瓜中克隆到-748 bp的PSY eDNA片段，GenBank登录号：(D0494214)，它编码247个氨基酸．经Blast比对后发现．与其他植物PSY氨基酸序列同源性在90％以上．但和BANG分离得到的PSY同源性很低。

1．4八氢番茄红素脱氢酶(PDS)

PDS催化八氢番茄红素向￡－胡萝卜素转化。Chamovitz等从大豆和番茄上分离到PDS。已报道从辣椒、拟南芥、玉米、黄水仙、野生烟草和白芥等植物中也分离到PDS．其eDNA长1．9～2．3 kb，编码566-582个氨基酸。本组已经从成熟西瓜果实中克隆得到这个基因的eDNA片段．GenBank登录号：EFl59942。

1．5类胡萝卜素异构酶(CRTISo)

Isaacson和Park等19-101分别从番茄和拟南芥中分离鉴定了类胡萝卜素异构酶(CRTISO)．并确认由八氢番茄红素转化为番茄红素是PDS、ZDS和CRTISO 3个酶共同作用的结果．它们的催化产物分别是9，9－二顺式－￡－胡萝卜素、7，9，7，9"-四顺式一番茄红素和全反式番茄。在植物和蓝细菌中．八氢番茄红素是经这3个酶作用转变为全反式番茄红素．而在细菌中是由单个酶(cRTI)催化。Bangt分离得到西瓜CRTISO cDNA全长，包括l 998 bp开放阅读框。本组克隆得到484 bp的CRTISO cDNA片段(GenBank登录号：FJ788510)，编码161个氨基酸．经比对发现与其他植物CRTISO氨基酸序列同源性在80％以上。

1．6胡萝卜素脱氢酶(ZDS)

ZDS催化z－胡萝卜素脱氢生成链孢霉素．继而进一步脱氢生成番茄红素。目前ZDS也已从辣椒、拟南芥和黄水仙中分离出来，其eDNA长1．8-2．1 kb。编码558-574个氨基酸。BangDt]报道了西瓜ZDS eDNA全长(2 062 bp)，包括1 758 bp开放阅读框。ZDS和PDS基因大小相近、编码的氨基酸同源性为29％-31％。本组从西瓜中克隆到422 bD的ZDS eDNA片段(GenBank登录号：GQl40241)，编码140个氨基酸，Blast比对后表明．与其他植物ZDS氨基酸序列同源性在80％以上。

2植物类胡萝卜素合成途径调控

2．1转录水平调控

高等植物的类胡萝卜素的生物合成受生长和个体发育的调控。不同发育阶段的花和果实所积累的类胡萝卜素的种类及量不同。用番茄PSY、PDS、LCYB和LCYE的eDNA作探

针，检测其果实发育过程中这些基因在转录水平的变化。结果表明，在果实进入番茄红素积累的转色期后．PSY基因的mRNA增加10-20倍，PDS基因的mRNA则增加近3倍．而LCYB和LCYE基因的mRNA却明显下降直到消失旧．番茄果实中番茄红素积累显然是由于转色期后合成番茄红素上游的PSY和PDS基因表达增强以及转化番茄红素生成胡萝卜素的LCYB和LCYE基因表达减弱的结果。Zhu等旧用克隆到的黄花龙胆类胡萝卜素合成基因作探针检测花瓣发育过程中的mRNA变化，结果表明PSY、PDS、ZDS、LCYB、BCH和ZEP基因的mRNA量逐渐增加．而LCYE基因的mRNA量逐渐减少。Ban利用RT-PCR方法研究西瓜成熟果实基因在转录水平的表达，PSY-A在不同瓤色西瓜中的表达没有明显的差异，在子房、花瓣和叶片中都有表达。PSY-B在所有瓤色西瓜中都没有检测到表达．在子房、叶片和根组织中却有表达。PDS、ZDS在所有瓤色中均有表达。CRTISO除了在深黄色西瓜中没有检测到表达外．在其他瓤色中均有表达。研究表明，PSY-A、PSY-B、CRTISO的调控可能在转录水平上。发育过程对类胡萝卜素生物合成的调控是在基因转录水平上。是通过调控相关基因的转录活性来控制类胡萝卜素代谢和积累的。已证实番茄、金盏草和黄花龙胆花中类胡萝卜素的积累也是在转录水平受到调控的。

2．2转录后调控

在植物类胡萝卜素生物合成过程中．转录后调控也非常重要，在水仙有色体中，游离型的PSY和PDS均没有生理活性，而与膜结合后，其生理活性便迅速被激活。Welseh等研究表明．在白芥幼苗的白化体内．PSY以无活性状态定位于原片层体(prolameIlarbody)上，而光照条件下，PSY与类囊体膜相结合，其活性和酶量也迅速增加。类胡萝卜素终产物反馈抑制也是类胡萝卜素合成过程中的一种调控方式．Camoisi等旧研究发现．向日葵中八氢番茄红素的积累会导致PSY基因表达量降低。在西瓜上目前还未见转录后水平调控的报道。

2．3调节基因调控

光信号传导基因对植物类胡萝卜素生物合成和积累也有一定的调控作用。Liu等利用RNAi技术对光信号传导基因LeHY5和LeCOPlLIKE进行调控．LeHY5和LeCOPILIKE分别为番茄果实色素正调控和负调控因子．当转基因植株中的LeHY5基因表达受到抑制时．叶片和未成熟果实变成淡绿色，叶绿素含量下降了24％～31％。相反．当转基因植株中的LeCOPILIKE基因表达受到抑制时．叶片和未成熟果实变成深绿色。这一结果说明．利用RNAi技术对光信号传导途径的组分基因进行调控．可以大幅度改变番茄果实的色素积累和营养品质。

3展望

目前．植物类胡萝卜素生物合成途径中大部分的基因均已被分离和鉴定．通过类胡萝卜素基因工程获得“金色大米”和“金油菜”极大地增强人们开展其基因工程的信心。但是．对于内源胡萝卜素合成的相关基因在不同植物中如何表达及调控知之有限，这使得在调控植物类胡萝卜素生物合成的基因工程研究方面因缺乏理论基础而带有盲目性。此外．通过基因工程改变类胡萝卜素的合成途径可能会干扰植物其他萜类化合物。如植物激素GA等的合成．影响植株的正常生长，因而更增加了植物类胡萝卜素基因工程研究的难度。

本组克隆到多个西瓜类胡萝卜素生物合成酶的基因．并初步分析了各基因在不同瓤色品种西瓜果实生长发育阶段的表达，为下一步转基因操作做好准备。目前．克隆西瓜类胡萝卜素代谢途径全部酶基因．研究基因在不同品种西瓜中的表达调控以及酶活性，将对提高或改变西瓜中类胡萝卜素组成和含量，丰富西瓜果实颜色，改良西瓜品质都有非常重要的意义。