耐盐基因Ｈａｌ１的克隆及表达载体的构建

沈　雁　陈　霞　陈　燕　龚　毅　陈宇光

摘要 以酵母菌株BWG1-7A基因组DNA为模板，利用PCR方法，扩增出耐盐基因Hal1，测序表明该基因全长为885个核苷酸，与已发表的序列NC_001148比较，同源性99.3%。将该基因插入表达载体pYES2的BamHI和EcoRI酶切位点之间，构建表达载体pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为植物表达载体的构建打下基础。

关键词 耐盐性；Hal1基因；克隆

中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2009）07-0243-02

Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid

SHEN Yan1，2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2

（1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences，Shanghai 200233；

2 School of life Sciences，Shanghai University）

Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template，Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes，then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence，which provided a foundation of the construction of plant expression vector.

Key words Salt tolerance；Hal1 gene；Cloning

随着全球水资源危机以及土壤盐化问题的加剧，盐胁迫已经成为影响植物生长、导致粮食和经济作物减产的主要限制因素[1]。目前，全世界大约有20%的农业用地的盐碱化程度在不断加重，预计到2050年，将会有超过50%的耕地会变得盐碱化[2]。在当前世界人口急剧增长、食品供给增长相对缓慢的情形下，只有采取一定的措施应对日趋严重的环境压力，才能确保人类的食品安全，维持农业生产的可持续发展。为了达到这一目标，就必须了解盐胁迫对植物生长发育的影响，弄清植物耐盐的机制，并通过农业和生物技术手段改良农作物，以增强它们的耐盐性，使其最终为人类的生产和生活服务。耐盐基因Hal1最初来源于啤酒酵母的第16号染色体，具有提高细胞中K+含量，降低Na+含量，也就是提高K+/Na+的比率[3，4]，从而可以提高细胞耐盐性的作用。本研究成功克隆了耐盐基因Hal1，并将它连接到pYES2表达载体上，测序表明其与已发表的序列比较，同源性99.3%，构建重组质粒pYES2-Hal1，序列测定完全正确，为下一步利用该基因提高生物的耐盐水平提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酿酒酵母BWG1-7A，大肠杆菌菌株DH5α，JM109，质粒pYES2均为中科院上海生命科学研究院实验室保存；KOD酶购自TOYOBO公司，T4连接酶、BamHI和EcoRI酶购自TaKaRa公司；质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司；引物由上海英骏生物技术公司合成；其他化学试剂购自上海生工公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母基因组ＤＮＡ的提取。将活化的菌种接种于YPD培养基过夜培养，收集菌体后用Lyticase 酶解酵母细胞壁获得原生质体，参照亚当斯A等[5]采用SDS裂解酵母细胞，提取酵母基因组总DNA。

1.2.2 Hal1基因的扩增。根据GenBank数据库中Hal1基因序列信息（序列登记号：NC_001148），用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，上游引物（P1）为5′－CGCGGATCCAT GCATTTCAAAGATTTAGGATTGCATACTACACTC－3′， 下游引物（P2）为5′-CCGGGAATTCTCAACTATTCTGT GTTG－3′，下划线分别代表BamHI和EcoRI酶切位点。在20μL PCR反应体系中加入模板DNA 1μL，10×反应缓冲液2μL，2.5 mmoL/L dNTP 1μL，P1和P2引物均为5μmoL/L，KOD酶0.5IU，94℃预变性5min后，进行PCR循环。循环参数为：94℃变性50s，53℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸10min。

1.2.3 重组质粒的构建与鉴定。将Hal1基因的PCR产物和pYES2载体经BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物分别回收，以1∶3比例连接，转化入DH5α感受态细胞，涂布于氨苄平板上。随机挑取3个菌落（1，2，3），扩大培养后，提取质粒，酶切鉴定后测序鉴定，重组质粒命名为pYES2-Hal1。

2 结果与分析

2.1 Hal1基因的PCR扩增

利用引物（P1，P2），以酿酒酵母基因组总DNA为模板，经PCR扩增得到了1条900bp左右的单一条带，与预期结果一致（见图1）。

2.2 Hal1基因的克隆

将上述PCR产物酶切回收与pYES2连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将随机挑取的菌落扩增后提取质粒，用BamHI和EcoRI进行酶切鉴定，第3号克隆酶切后电泳得到约900bp大小的片断（见图2）。

2.3 重组质粒pYES2-Hal1序列测定

进而将3号克隆测序，结果显示，该核苷酸序列与Genbank数据库已报道的序列相比，同源性为99.3%（见图3）。

3 结论与讨论

酿酒酵母BWG1-7A具有较强的耐盐能力，可在含有7%NaCl的YPD培养基中生长。本试验通过PCR技术，成功地从其DNA中克隆到耐盐基因Hal1。测定的阳性克隆序列，与GenBank上公布的Hal1基因相比较，其核苷酸同源性为99.3%。与已发表的序列同源，将为Hal1基因植物表达载体的构建和转化提供有力保障。

酵母菌的遗传物质结构、基因表达和调控过程等都与高等生物具有一致性，因此已将其作为一种研究农作物耐盐机制的模式生物得到广泛应用[6]。本研究采用的酿酒酵母，是分离耐盐基因的有效模型，有助于高等植物耐盐分子机理的研究，推动抗渗透胁迫工程的发展。

盐碱地是巨大的潜在资源，绿化盐碱地是扩大耕地面积，进一步发展农业生产、改善生态环境的重要措施。利用基因工程手段培育能在盐碱地上种植的林木，是利用盐碱地的一条经济而有效的途径。酿酒酵母Hal1基因在盐胁迫下能与促进Na+外排的ENA1基因及其他转运系统协同作用保持细胞内低的Na+/K+比，以减轻Na+毒害，因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力[3]。

4 参考文献

[1] 周和平，张立新，禹锋，等.我国盐碱地改良技术综述及展望[J].现代农业科技，2007（11）：159-164.

[2]V INOCUR B，ALTMAN A. Recent advances in engineering p lant tolerance to a biotic stress： achievements and lim-itations[J].Current Opinion in Biotech-nology，2005（16）：123-132.

[3] R GAXIOLA，IF DE LARRINOA，JM Villalba，et al.A novel and conserved salt-induced protein is an important determinant of salt tolerance in yeast[J].EMBO，1992，11（9）：3157-3164.

[4] MARQUEZ JA，SERRANO R.Multiple transduction pathways regulate the sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt stress in yeast[J]. FEBS letters，1996（382）：89-92.

[5] 亚当斯A，戈特施林D E，凯泽C A. 酵母遗传学方法实验指南[M].刘子铎，译.北京：科学出版社，1998.

[6] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al. T ransfer of the yeast salt to lerance gene HAL 1 to cucum isme cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Res，1997，6（1）：41-50.