蛋白质定量分析的研究进展

刘雅超　刘　旭　白鸿源　房泽海

【关键词】蛋白质；定量分析；研究

【中图分类号】R【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0049-02

1蛋白质定量检测的生物化学方法

1.1凯氏定氮(Kjeldahls Method)及分光光度法利用蛋白质含氮量进行检测的经典方法，优点是定量准确，但操作烦琐，仅用于标定蛋白质标准品和校正其他测定方法。凯氏定氮法有半微量法、微量法及全量法。样品与H₂SO4一同加热消化，分析有机物，释放出的NH3与结合，碱化蒸馏使氨游离，硼酸吸收，HCI或H₂SO4标准溶液滴定，从而计算蛋白质的含量。该方法是以Hantzsch反应为原理所建立的一种测试蛋白质含量的新的分光光度法。适用于各类食品中蛋白质的测定，且不需要特殊的凯氏定氮装置。取样且少，消化时间短，精密度高准确度好，适用于大批样品同时测定，亦适用于微量蛋白质分析，是一种蛋白质快速、准确测定的新途径。

1.2双缩脲法(Biuret Assay)双缩脲法简便易行，但检测灵敏度相对较低，最低测定值100μg。必须在测定前先使蛋白完全沉淀，除去干扰物质，才能得到较准确的结果。除三氯乙酸作沉淀剂外．还可用钨酸、磷钨酸和Tsuchiya试剂，双缩脲法优点是对白、红蛋白产生颜色反应相近、干扰物质少，不受温度的影响。但灵敏度低，0.01吸光度相当于l66.7μg蛋白，且操作复杂，很难用于自动化仪器分析。

1.3Lowry法（Lowry Assay）结合双缩脲法中铜盐反应与Folin-ciocalteau试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基Tyr和Try的迅速反应与肽链、极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应．而把磷钼酸发色团还原成暗蓝色、在波长750nm处测定Amax。

1.4BCA法(Bicichoninic Acid Assay)BCA法的灵敏度为0．5～10μg/ml，其最低测定值与反应温度有关。有37℃和60℃(增强法)2种反应温度：在37℃时，一般适用于浓度较高的样品(＞50μg/ml)，但是色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下得不到彻底的氧化(37℃时该方法检测的蛋白质浓度范围为20～2000μg/ml)；在60℃(增强法)时，一般适用于浓度较低的样品(＜50μg／ml)，色氨酸、酪氨酸和肽键在此温度下能得到充分氧化，因此能大大提高检测灵敏度(60℃时该方法检测的蛋白质浓度最低可达5μg/ml)。

1.5丹宁酸法丹宁酸用来沉淀蛋白质，但沉淀结构松散。可用Caiilne取代蛋白，蛋白游离出后用免疫法或空氮法测定，但此法操作麻烦、加FeCl3与丹宁酸蛋白沉淀反应显色，5min后在510nm比色，0.1mol的丹宁酸可结合0.333μg白蛋白、灵敏度达5ml•L-1，线性范围为0.05～1.8g•L-1。

1.6浊度法(比浊法)利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白浓度的定量分析法。磺基水杨酸和三氯化铁是常用的蛋白质沉淀剂。30g•L-1磺基水杨酸作为沉淀剂可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白。50g•L-1三氯乙酸蛋白作沉淀剂，可沉淀白蛋白和球蛋白。

1.7染料结合法(Dye Combination Assay)是利用蛋白质与染料结合的性质进行检测的方法。常用的染料有：考马斯亮蓝(coomassie bril1iant blue，CBB)G-250或R-250、丽春红S(ponceau S)、氨基黑(amido black)、溴甲酚绿(bromcreso1 green，BCG)和溴甲酚紫(bromcreso1 purple，BCP)等。

1.8紫外分光光度法(ultravio1et Spectrophotometry)是利用蛋白质在紫外280nm处有最大吸收峰的现象，进行检测的方法，具有简便、快速且可回收样品的优点。紫外分光光度法检测蛋白质的最低测定值为10Pg。

1.9荧光法这是近几年兴起的一种新的定量测定蛋白质的方法，观已报道的络天青S、次氯酸盐—硫胺素及白蛋白蓝670法测定蛋白质的方法，其灵敏度较低。

1.10金属离子-染料结合法借用金属离子－染料和蛋白质在适宜条件下反应进而检测蛋白的方法发展很快，钛-4，5-二溴基荧光酮(DBPF)-Tween-80与蛋白质的显色反应用来测定微量尿蛋白。在pH2．9，血清蛋白能与钛-DBPF-Tween-80形成蓝色络合物．λmax＝605nm，加入少量乙醇能提高方法的灵敏度及稳定性。

2蛋白质定量检测的免疫法

2.1免疫扩散法所谓抗原是指引起机体产生抗体的物质，而抗体是指在抗原的刺激下机体产生的物质。抗原与抗体结合生成沉淀以达到机体免疫的目的，抗原与抗体属于蛋白质化合物。

2.1.1环状免疫单扩展法将一定量的抗体（一般常用单价抗血清)与含缓冲液的琼脂糖凝胶混匀铺成适当厚度的凝胶板，再把抗原滴进凝胶板的小孔个，在合适的浓度和湿度环境中、经过一定的时间，抗原由小孔向四周扩散(呈辐射状)，与已沉匀在琼脂糖凝胶中的抗体相互作用。

2.1.2双向扩展法一定浓度的琼脂糖(或琼脂)凝胶是多孔的网状结构，大分子物质可自由通过，这种分子的扩散作用可使分别在两处的抗原和相应抗体相遇．形成抗原－抗体复合物．比例合适时出现沉淀，沉淀的特征与位置取决于抗原分子量的大小、分子结构、扩散系数和浓度。如果抗体存在于多种有机大分子中出现多条沉淀线，即可定性抗原，诊断疾病。此法操作简单且灵敏度高，是最常用的免疫法。

2.2琼脂糖免疫电泳法免疫化学与琼脂电泳相结合形成了免疫电泳技术，这是一种灵敏度很高的蛋白质分离及鉴定技术，可用于定性、定量测定抗原或抗体。此技术是1953年由Grabar及wilillims提出，后来由Scheigger改进形成的一种微量蛋白质测定法。可分为以下几种常用免疫电泳法：

2.2.1微量免疫电泳法在有离子的琼脂糖的玻璃中心各挖一长槽，槽的两侧各挖一个小圆孔，孔内加入待测样品，电泳时，由于样品中各蛋白质的等电点不同，其带电性不同，因而被分离成几个区带。电泳后在长槽中加入相应的抗血清37℃时扩散，分离的蛋白质就与相应的抗体形成大小不同、深浅各异的沉淀弧。一般情况下每一沉淀弧代表蛋白质混合物中一种成分，以此进行定性、定量。

2.2.2对流免疫电泳将抗原和抗体分别加入琼脂板样品孔内同时进行电泳，抗原由阴极向阳极移动，抗体向阴极倒退，两成分相遇，特效抗原与抗体结合，形成可见的白色沉淀物，即对流免疫电泳．这种方法是抗原与抗体在电场作用下定向移动，限制了抗原与抗体的自由式扩散，可提高灵敏度16倍。

2.2.3火箭电泳法取一定量单价血清，与一定量琼脂凝胶混匀，然后铺板，板上挖几个小孔，每孔中加不同浓度的相应抗原，将此板放在pH8.6的电泳槽中进行电泳，在电场作用下抗原向正极泳动，在泳动中与凝胶中的抗体反应，逐渐形成类似火箭的沉淀峰．其峰的高度与抗原的浓度成正比，以此可定量抗原。国外有人用此法测定了全血清中的C-活性蛋白质。如果被测抗原等电点与单价血清(抗体)的等电点相同，不仅需要用琼脂糖，而且需对抗原进行化学处理，使负电荷相对增加，这样处理后才能出现火箭峰。处理时，一般用氰酸钾或甲醛。

2.2.4双向定量免疫电泳法双向定量免疫电泳法又称交叉电泳。先将抗原进行电泳分离蛋白质的各组分；放在抗体琼脂板上，使各组分在垂直方向再电泳一次，根据各组分和沉淀峰便可定性、定量抗原。

2.2.5放射免疫电泳法RIA法是将放射性同位素测定法和免疫反应相互结合的一种技术，优点是特效、敏感、精确、简单。一般不需要复杂的提纯步骤。目前该法已用于细菌和病毒抗原的分析、抗体的测定，各种免疫球蛋白和血清蛋白的定量测定及肿瘤有关的抗原测定等。

2.3毛细管电泳免疫法在用琼脂糖免疫法定量分析抗原和抗体蛋白质时，抗原和抗体的纯化是非常麻烦的问题。近年来发展较快的是毛细管免疫电泳，它的分离速度快、分辨率高且不受染色时间、温度、染色剂浓度、显色时间等因素影响。诸多优点使其广泛地应用于包括球蛋白在内的各种临床指标的检测。

蛋白质定量检测技术发展至今已经建立了许多成熟的方法，且衍生出了众多试剂盒。但在实际工作中，无论是使用自配试剂还是商品试剂盒来进行蛋白定量，往往忽视了需根据待测定蛋白质的特性选择合适的方法和标准品，造成蛋白定量结果的不可靠。随着蛋白质定量检测的日趋频繁和检测要求的日益提高，正确选择、应用蛋白质定量方法和标准品，应该引起有关人员的高度重视。

参考文献

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[3]张滨．人体血液蛋白的毛细管电泳分析进展[J]．分析化学，1997，25(8)：973-977

(收稿日期：2009.01.26)