血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗疾病的相关研究

冉昌丽　李耀彩　张其梅　彭　玉

【摘要】血管内皮细胞生长因子(VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子,VEGF特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成。因此,以VEGF为基础的治疗性血管生成的研究备受关注。

【关键词】血管内皮细胞；生长因子；干细胞移植

【中图分类号】R318.06【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0032-02

1骨髓间充质干细胞

1.1BMSC的生物学特性间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞,为多能干细胞,主要存在于全身结缔组织器官间质中,其中以骨髓组织中含量最为丰富,称为骨髓间充质干细胞。其具有自我更新和多向分化的潜能,在不同的微环境中能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、纤维细胞、内皮细胞等,特别是能够横向分化为神经细胞。其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植等特点。BMSC没有特异性的表面标志，在其表面存在一些与造血干细胞不同的表面抗原，目前一致认为BMSC对于CD29，CD44，CD90，CD105，CD71，SH-2,SH-3等呈阳性反应，同时对于造血干细胞的表面标志CD11b、CD45、CD34等呈阴性反应^[1,2]。形态上多呈扁平梭形或星形细胞，因此BMSC可通过细胞的表面标志和细胞形态进行初步鉴定。目前常用的BMSC分离的方法主要有三种：贴壁筛选法、密度梯度离心法和流式细胞仪分离法。

1.2BMSC作为种子细胞治疗疾病的优越性BMSC具有很多其他干细胞没有的特性,使其成为很多治疗疾病的种子细胞:①可来源于自体,取材方便,分离获取容易,没有伦理学争议。②在体外培养能快速扩增,且能永久分化,可诱导分化为各种细胞。免疫原性弱,安全性好。④能在组织中成活、迁移和分化。⑤可分泌多种细胞因子、集落刺激因子、干细胞生长因子、多种黏附分子等 ,在组织发育及分化过程中发挥重要作用。因其有以上优越性,表明BMSC是疾病治疗的理想种子细胞之一。

1.3BMSC作为外源性基因细胞载体的优越性①转染后骨髓间充质干细胞仍可以保持其干细胞的多向分化潜能。②外源性基因的产物可随骨髓间充质干细胞迁移至缺血损伤区,充分发挥其作用,改善组织修复的微环境。③骨髓间充质干细胞可转染外源性营养因子促进自身和神经干细胞存活、增殖、分化,同时亦可转染凋亡基因如 bcl-2等抑制脑细胞凋亡,减轻神经组织的进一步缺血损伤。因此,通过导入目的基因,将细胞治疗与基因治疗相结合,对脑梗死的治疗将具有更广泛的前景。

2血管内皮细胞生长因子

2.1VEGF的生物学特性VEGF特异性促使血管内皮增殖的有丝分裂原，是机体内促使血管生成的最主要生长因子，其功能是刺激血管内皮细胞生长，启动血管形成和增加血管通透性，并能与内皮细胞表面的特异性受体结合，强烈的促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，在胚胎发育、创伤修复、侧枝循环建立等病理生理过程中发挥重要作用。VEGF165在组织和细胞中的含量最丰富，而且它是一种分泌性生长因子，广泛地在多种组织细胞中表达，不仅具有促进血管生成活性，而且其表达产物是可溶性的。从细胞中分泌出来，扩散性强，易到达靶细胞，能很好的发挥生物学活性。

2.2VEGF基因转染BMSC移植治疗疾病的优势对于移植的BMSC进行VEGF基因修饰后，就会从几个方面加强疾病的治疗作用。㈠大量的血管新生可以改善梗死边缘区休眠细胞的血供，改善和恢复其功能；㈡血管内皮细胞生长因子在促进血管新生的同时，还可以直接刺激血管扩张，血供的改善可以提高移植细胞的成活率并为其以后的长期增殖分化提供一个良好的生存环境；㈢移植细胞存活数量可能增多，因为通过对移植细胞的基因修饰可提高其移植后的存活率。因此，将细胞治疗和基因治疗结合起来将是一种新的较好的方法。

3VEGF基因转染入BMSC的方法

3.1重组载体导入真核细胞的方法将重组载体导入真核细胞的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀法，电穿孔法，DEAE-葡聚糖法，脂质体介导法，原生质融合法；病毒载体转染法，细胞核直接注射法。其中阳离子脂质体介导基因转染是近年来外源性基因导入宿主细胞的常用方法之一。

脂质体是由生物可降解成分组成，以其靶细胞范围宽、转化效率高、应用简便、毒性小、对包裹的基因没有限制，又没有病毒做载体引发生物变异和癌变的可能性等优点正受到越来越多的重视。因此在实验室研究和临床基因治疗中得到了广泛的应用。

脂质体转染基因的作用方式主要是通过脂质体与细胞膜相结合，由于其与细胞膜有相似的结构产生了脂质体与细胞膜融合，或者通过内吞的形式使得外源基因进入胞内，但是阳离子脂质体介导的外源基因主要是通过内吞的形式进入胞内，在胞内释放外源基因或者进一步与核摸结合使得外源基因直接进入细胞核，减少了外源基因被溶酶体降解，同时由于阳离子脂质体带有正电荷而核酸分子及细胞膜的电荷都是负电荷，所以阳离子脂质体与核酸和细胞膜的结合力都大大增加，从而增强了脂质体介导的转染效率。

3.2影响脂质体介导VEGF基因转染入BMSC的因素①阳离子脂质体的组成；②脂质体与DNA的比率；③脂质体的总量；④细胞密度以及脂质体/DNA复合物与细胞作用的时间；⑤转染时所用的培养液是否含有血清等。由于脂质体具有细胞毒性作用是影响基因转染效率的重要因素,因此适时终止其胞毒作用是很关键的。

4BMSC修复组织损伤的机制

大量研究表明BMSC能有效修复组织损伤, 使其功能和结构缺损得到恢复, BMSC的组织修复机制有以下几方面:①BMSC能直接分化为相应的组织细胞；②分泌营养因子促进修复；③促进内源性干细胞迁移与分化；④促进新生血管形成；⑤BMSC对损伤部位靶点的归巢；⑥抑制炎症因子的表达。

5影响BMSC移植治疗效果的因素

5.1移植BMSC的时机移植时机的选择需要考虑两个方面的影响:一是在缺血的早期,毒性物质、促炎递质和氧自由基的释放等微环境的改变对移植细胞的影响。同时,组织损伤亦释放趋化因子等使干细胞迁移至损伤部位参与修复,即缺血后组织的自身修复过程有利于细胞的存活、分化。二是在缺血的慢性期,纤维组织的形成阻碍了移植细胞的迁移、生长、整合。

5.2移植BMSC的途径脑局部立体定向注射细胞移植是一种创伤性手术,有可能会损伤正常脑组织,不易为患者接受,而经静脉或动脉注射较脑局部注射优越,因移植细胞分布更广,每次可移植的细胞数更多,操作更为方便,不需特殊装置,将来临床应用中患者更容易接受。

5.3移植BMSC的浓度BMSC的浓度影响着移植治疗的效果,研究表明,MAPCs浓度为3～6×106时,神经功能缺失症状均有恢复,而MAPCs浓度为1×106时,神经功能恢复不明显。MAPCs浓度太低,达不到治疗效果,浓度太高又易致静脉栓塞。

6VEGF基因转染BMSC的治疗应用

6.1缺血性心肌病周文武等心肌缺血动物模型中，移植后4周用Buxco系统于Wistar大鼠心尖置测压管进行有创动态心功能测定。结果表明：冠状动脉结扎后各组的大鼠收缩功能及舒张功能均受损，导致了心功能不全；在治疗后，联合组、细胞组及基因组动物均显示有不同程度的心功能改善，以联合组最明显，且心肌梗死面积明显小于对照组、细胞组、基因组，同时，细胞组、基因组动物又明显小于对照组。这说明联合治疗在抑制心室扩张、限制心室重构及促进心肌细胞修复，缓解心功能进行性下降等方面要优于单纯的细胞治疗或基因治疗；即认为血管内皮细胞生长因子基因转染BMSC移植于心肌缺血区，其疗效可能优于细胞治疗与基因治疗的单独应用。因此采用基因转染的方法将VEGF导入 MSC中就有可能使BMSC在发挥心肌修复作用的同时表达分泌 VEGF,从而促进血管的生成,有利于血管化心肌组织的新生,提高组织工程心肌组织修复缺血心肌的效果。

6.2骨缺损对骨发生，骨修复的研究证实，血管入侵是骨形成的关键环节，血管内皮细胞生长因子是其中的关键生长因子，不仅可促使血管内皮细胞的募集，迁移，增殖，协调着血管生成，并且介导成骨细胞，软骨细胞，破骨细胞等的分化及功能。骨内血管生成是骨形成早期的关键环节，骨生发中心即位于血管化的环境中，无论膜内成骨，软骨内成骨都与血管生成密切相关。禹志宏等在腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点的研究中证实人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。 Zelzar等表明血管内皮细胞生长通过增加格根包尔氏细胞在骨膜内和软骨内的活性来促使骨的形成。J.Wang 等表明Ad-VEGF165组诱导骨形成的时间比阳性对照组早2周，这说明Ad-VEGF165能缩短骨形成的时间。在临床上，我们可以发现它能缩短治疗周期和降低细胞污染的危险性。

7小结与展望

血管内皮细胞生长因子(VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子,VEGF特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成。因此,以VEGF为基础的治疗性血管生成的研究备受关注。VEGF在很多正常及病理的人或动物组织中的表达水平较低无法形成有效浓度，并且VEGF蛋白的生物半衰期非常短，仅为6分钟，即使直接将VEGF应用于损伤处也会被周围组织中的酶类很快降解，不能持续发挥作用，为了解决这个问题，许多学者采取了基因治疗的手段通过许多实验也都证实了通过转基因技术可以使VEGF蛋白在机体局部持续、高效表达，为治疗各种缺血性疾病、骨折、骨缺损、骨坏死等提供了一种有效的途径。骨髓间充质干细胞（BMSC）由于具有多向分化潜能，取材方便安全、来源丰富、损伤小，易于体外培养扩增，在体外可长时间保持未分化状态，体外基因转染率高，并能稳定高效表达多种治疗性外源基因，而且自体获取的BMSC回植后不会发生免疫排斥反应等优点，BMSC已经成为重要的组织工程种子细胞，因此随着组织细胞工程学和基因工程学的兴起，若与其多向分化潜能相结合，通过导入目的基因，将细胞治疗和基因治疗结合在一起，这在临床应用中将会有广阔的前景。如将二者结合起来治疗神经系统方面的疾病，这将为神经临床科医生开拓新的思路和方法。

虽然对BMSC的研究已经取得了惊人的成果，但是也还有许多问题没有解决。目前BMSC的鉴定、分离纯化等还未形成成熟的技术体系,BMSC在体外诱导和体内移植的生物学机制还未阐明，以及通过病毒载体如腺病毒将VEGF转染到BMSC中，虽然效率高，但存在着免疫反应的危险，何适时调控VEGF表达等问题还需要深入研究。

(收稿日期：2009.02.02)