缺血性脑损伤中硝酸甘油对神经元的保护及Ａｋｔ信号通路的影响

张　芳　刘红芝

【摘要】 目的 探讨硝酸甘油(NG)对大鼠缺血性脑缺血再灌注中Akt和Bad(ser136)磷酸化的影响。方法 36只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)、硝酸甘油组。以大鼠四肢动脉结扎脑缺血模型为基础，应用焦油紫染色法检测海马CA1区神经元凋亡，采用免疫印迹检测Akt和Bad(ser136)的磷酸化。结果 硝酸甘油组脑海马CA1区神经元凋亡显著少于对照组(P<0.05)；硝酸甘油组Akt、Bad(ser136)的磷酸化显著高于对照组 (P<0.05)。结论 硝酸甘油能显著减轻脑缺血再灌注后脑海马CA1区神经元凋亡，明显提高Akt、Bad(ser136)的磷酸化水平，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用。

【关键词】 脑缺血；硝酸甘油；海马；Akt

Protection of nitroglycerine on neurons and effect on Akt signaling pathway during ischemic cerebral stroke in rats ZHANG Fang，LIU Hong-zhi.School of Basic Medical Science，Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu，221004，China

【Abstract】 Objective To investigate the effect of NG on the phosphorylation of Akt and Bad(ser136) during ischemic cerebral stroke in rats.Methods 36 Adult male SD(Sprague-Dawley) rats were randomly divided into sham-operated group，ischemia-reperfusion group(control group)，NG opener treatment group(NG group).Basing on the four-vessel occlusion models，neuron apoptosis in CA1 region of hippocampus was detected by cresyl violet staining，the phosphorylation of Akt and Bad(ser136)were detected by immunoblotting.Results The number of apoptotic neurons in NG group were significantly more than that of control group(P<0.05).The phosphorylation of Akt and Bad(ser136) in NG group was significantly less than that in control group(P<0.05).Conclusion Nitric oxide donor NG has a protective effect on neuron in CA1 region of hippocampus following cerebral ischemia-reperfusion by significantly increasing the phosphorylation of Akt and Bad(ser136)and neuronal apoptosis.

【Key words】 Cerebral ischemia；Nitroglycerine；Hippocampus；Akt

一氧化氮(nitric oxide，NO)是非经典神经递质和细胞功能调节因子，它维持神经系统的正常功能和对缺血性脑损伤的保护作用日益受到关注，但具体机制不十分清楚。本实验通过观察NO的供体硝酸甘油(nitroglycerine，NG)对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡及Akt和Bad(ser136)磷酸化的影响，以探讨其脑保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组 健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠 36只，体质量 250～300 g，清洁级。大鼠被随机分为两组，缺血15 min再灌5 d为甲组，再灌12 h为乙组。各组又分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)、硝酸甘油组，各6只。甲组用于海马CA1区神经元凋亡检测，乙组用于Akt和Bad(ser136)磷酸化测定。

1.2 动物模型制备及给药方式 用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉动物后，参照宋远见等^[1]实验分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后再灌注不同的时间，缺血时保持其直肠温度在36.5℃～37.5℃，以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。硝酸甘油组于缺血前20 min给药，腹腔注射硝酸甘油5 mg/kg。

1.3 焦油紫染色 甲组于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，接着以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后，于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包腊后的脑块进行切片(5 μm)，经脱蜡、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA1区1 mm内的细胞数量作为计数标准。

1.4 Akt和Bad(ser136)磷酸化免疫印迹检测 乙组于再灌12 h将大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马，加1.7 ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆(10 s×6次)，800 g×10 min离心，弃上清液，加入0.6 ml buffer B振荡摇匀，12 000 g×10 min离心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白，经过计算，各组样品配成相同蛋白浓度后分装，置-80℃冰箱待用。等量蛋白样品经7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，以湿转法电转移至NC膜上，转移缓冲液：25 mmol Tris，190 mmol甘氨酸，20%甲醇和0.05%SDS。转移后的NC膜经封闭液室温封闭3 h后加入一抗p-Akt、p-bad(ser 136)，4 ℃过夜。用洗涤液洗膜三遍，加入二抗羊抗兔IgG-AP，37℃反应2 h，洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。用图像处理仪(Gene Company)对结果分析处理，假手术组的灰度设为1，其他各组以假手术组为标准分别计算出相对值。

1.6 统计学方法 以 SPSS 11.0统计软件进行分析处理。所有数据经检验方差具有齐性，以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

因本实验室以前的研究已证实，与假手术组相比，脑缺血再灌注组第5天海马神经元损伤严重；脑缺血再灌注后15 min时脑组织中Akt和bad(ser 136)的磷酸化程度相对假手术组明显降低，30 min时开始升高，3 h时达到最高，而后逐渐降低，到12 h时回到与假手术组相近的水平，实验证实这一回落导致了细胞严重损伤(P<0.05)[2]。故本文仅取甲组的存活神经元数、存活量表示大鼠海马CA1区神经元细胞存活情况，用乙组的Akt和Bad(ser 136)数值表示大鼠Akt和Bad(ser 136)的磷酸化情况。见表1。

2.1 神经元凋亡 假手术组海马CA1区仅仅有少量细胞凋亡，对照组凋亡细胞与假手术组相比明显增多(P<0.05)，硝酸甘油组凋亡细胞较对照组显著减少(P<0.05)。见表1。

2.2 Akt和Bad(ser136)的磷酸化 假手术组和对照组Akt和Bad(ser136)的磷酸化有一定水平，硝酸甘油组Akt和Bad(ser136)的磷酸化较对照组显著升高(P<0.05)。见表1。

3 讨论

NO作为细胞间信使物质在中枢神经系统行使多种生理功能，同时它还是一种重要的脑缺血损伤介质，参与血管调节、神经递质传递、炎性反应、免疫反应等过程。脑海马CA1区是对缺血最为敏感而发生大量细胞凋亡的区域之一，本实验通过焦油紫染色法检测海马CA1区神经元的凋亡情况证实了这一点。在本实验中以硝酸甘油作为NO的供体，实验结果显示：硝酸甘油组海马CA1区神经元凋亡明显少于对照组，说明NO对脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元凋亡具有较好的保护作用。

近年来研究表明，Akt活化后能经多种途径促进细胞存活，其重要机制之一就是通过磷酸化 Bcl-2家族成员Bad实现其促进生长的作用。Bad是否磷酸化关系到细胞的成活和死亡，是神经存活因子控制神经细胞凋亡的重要环节。Bad的功能受它的Ser-112和Ser-136位点磷酸化所调节。磷酸化的Bad能与伴侣蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白相互作用，Bad-14-3-3结合物可释放Bcl-2和/或 Bcl-xl，发挥抗细胞凋亡效应。Akt是强有力的Bad(Ser-136)激酶，活化的 Akt可以使Bad的Ser-136位点磷酸化，有效阻断 Bad诱导的细胞死亡。本实验室研究发现，脑缺血再灌注后15 min时脑组织中Akt和bad(ser 136)的磷酸化程度相对假手术组明显降低，30 min时开始升高，3 h时达到最高，而后逐渐降低，到12 h时回到与假手术组相近的水平，实验证实这一回落导致了细胞严重损伤^[2]。本实验结果证明：硝酸甘油可以明显上调12 h时Akt和Bad(ser136)的磷酸化水平，减少神经元凋亡，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

参 考 文 献

[1] 宋远见，裴冬生，孙亚峰，等.脑缺血再灌注后依达拉奉联合黄芪对大鼠神经元的保护作用及机制.山东医药，2008，48(22)：6-8.

[2] Wang XT，Pei DS，Xu J，et al.Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by AKT1 and AKT on ischemic brain injury.Cell Signal，2007，19(9)：1844-1856.