甜瓜同源四倍体的创制及其初步定性研究

贾媛媛　张永兵　刁卫平　陈劲枫

摘要：通过未成熟胚子叶的组织培养创造体细胞无性系变异，诱导出了齐甜1号的同源四倍体甜瓜，激素质量浓度以BA3.0mg/L为佳，加倍率为14.3％。对再生的同源四倍体及二倍体甜瓜植株进行了茎、叶、花、果实、种子的形态观察，及各项形态指标和主要品质指标的测定。结果表明：除果形指数变小外，四倍体植株的茎、叶、花、果实、种子各项形态指标的值均显著大于二倍体。同时，四倍体甜瓜维生素C、可溶性糖含量也显著高于二倍体。

关键词：甜瓜；未成熟胚子叶；同源四倍体；形态；品质

同源多倍体是遗传和育种研究的重要材料。多倍体的“巨型性”及次生代谢产物增加和抗逆性增强的特性可被用来改善植物农艺性状、增加产量、改善品质。多倍体育种可创造新的种质资源，扩大种质资源的利用范围，通过多倍体诱变、远缘杂交等使野生种与栽培种的优良性状相结合，产生并固定杂种优势。

在植物多倍体诱导中，利用组织培养过程中的无性系体细胞变异出现自然加倍获得四倍体再生植株具有成功率高、可一定程度避免嵌合体的产生及条件易调控等优点。本文通过未成熟子叶培养过程筛选鉴定同源四倍体甜瓜，建立同源四倍体诱导体系，并且对获得的同源四倍体甜瓜进行了形态观察和品质测定，为甜瓜多倍体育种实践打下了一定的基础。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为早皇后、9904、4810、黄金瓜、齐甜1号、新青玉，其中早皇后是地方常规品种，4810为多抗源复合杂交后的低代自交系，其余4个为杂交F，代品种。试验于2006年在南京农业大学进行。

1.2方法

1.2.1未成熟子叶培养从田间摘取发育18～23d的未成熟果实，经流水冲洗果面后在超净工作台上用75％的酒精进行表面消毒。然后剖开果实，取出尚未发育成熟的种子。去掉种皮并切取近胚轴端子叶中部组织作为外植体，接种在诱导无性系变异培养基上。诱导培养基共4种，分别为：MS+BA 1.0mg/L；MS+BA 2.0 mg/L；MS+BA 3.0 mg/L；MS+BA 4.0mg/L。每个处理接种约20个外植体，置于弱散射光条件下诱导培养。培养至叶面或叶缘产生芽丛后，将芽丛及时切下，转移到生长培养基(MS+BA 0.2 mg/ L)上，以促进芽伸长。

除特别说明外，所有培养基均为固体培养基，附加3％蔗糖，0.8％琼脂，pH值5.8左右。培养条件：温度(25±2)℃，每日光照16 h，光照度2 000 lx左右。

1.2.2倍性鉴定将驯化后的植株移栽于南京农业大学蔬菜试验基地。植株长出2-3片真叶后，取长0.5～1.0 cm的细嫩卷须，参照陈劲枫等的方法进行有丝分裂染色体制片，以确定植株染色体数目，统计处理芽数、愈伤组织数、出芽数、变异芽数和加倍芽数，计算出愈率(愈伤组织数/处理芽数)、出芽率(出芽数/处理芽数)、变异率(染色体数目发生变异的株数/处理芽数)和加倍率(加倍株数/处理芽数)。

1.2.3形态性状观察甜瓜进入盛花期，测量植株第3、5、7、9节的节间长、茎粗、叶长、叶宽、叶柄长、叶柄粗等形态指标；每株分别取5朵当天开放的雌、雄花，测量花萼长、花辦长和花辦宽。授粉20d后测果实纵径、果实横径、单果质量并计算果形指数(果实纵径/果实横径)。果实成熟期，采摘四倍体再生植株及二倍体植株果实5个，每个单瓜随机选择20粒种子进行观察、测量。

1.2.4维生素C及可溶性糖含量的测定参照李合生的方法，从田间摘取发育正常的甜瓜果实，洗净、擦干，用不锈钢刀取果肉2g，磨碎后用比色法测定维生素C含量。同时，采用蒽酮比色法测定叶片可溶性糖含量。均重复3次，数据采用SPSS软件进行LSD测验。

2结果与分析

2.1未成熟胚子叶经诱导后组织再生情况

白色的未成熟胚子叶外植体(图版1 A)接种在诱导培养基上2～5 d后急速膨大变绿(图版1B)，切口边缘形成少量愈伤组织，10～15 d后子叶边缘或表面开始分化出芽丛(图版1C)或形成愈伤组织块(图版1D)。出芽部位多集中在外植体近下胚轴一端切口边缘与维管束交接处，另一端则较少，30d左右芽长达1～2 cm。将芽丛切下转移至伸长培养基中培养(图版1 E)，离体条件下发生变异的小植株已经可以看出其叶片与普通二倍体的不同(图版1 F)。将所有植株生根后进行驯化。

2.2不同质量浓度的激素对甜瓜未成熟胚子叶再生及加倍的影响

试验共设4个不同BA质量浓度诱导甜瓜无性系变异的发生。表1结果显示，BA较高的培养基出愈率也较高，出芽率则相对较低；相反，BA较低的培养基出愈率较低，出芽率则较高。观察得到，BA质量浓度较高的培养基相对于较低的培养基，芽丛和愈伤组织块较为紧实，分化单芽频率也较低，而低BA质量浓度培养的芽丛和愈伤组织块则相对疏松，分化单芽频率也较高，

不同BA质量浓度诱导外植体产生无性系变异，成株训化后经细胞染色体计数鉴定，获得了2n=48的四倍体。各处理的诱导结果如表l所示。BA质量浓度不同对四倍体出现频率有较大影响。表1显示，齐甜1号以BA 3.0 mg/L最好，加倍率达到14.3％，而4.0 mg/L时加倍率仅为6.9％。

2.3再生四倍体植株形态特征观察

由表2～4可知，除节间长、叶柄长、萼片长、果形指数、单果质量外，四倍体植株的茎、叶、花、果实、种子的大多数形态指标值显著大于二倍体，且除雄花、雌花的萼片长外，二者的差异都达到了极显著水平。四倍体的果形指数为0.78，二倍体为1.68，二者差异极显著。

根据田间观察结果可知，由于四倍体植株的茎、叶、花外形上具有明显的巨大性，生长较为缓慢，叶片肥厚，形状钝圆，叶色深绿(图版2A右)，畸形叶较多，且多发于植株较低或基部节位(图版2 B、C、D)，再生的四倍体植株茎节变得短粗，分枝力较之二倍体植株差，开花期，花器官变大，花辦颜色变深(图版3)，花辦肥厚，雌蕊和子房增大，且大多数雌花着生于主蔓茎节基部，而二倍体植株的雌花则多着生在延伸出的侧蔓上：果形指数极显著低于二倍体，果实较为短粗(图版4A)；种子增大加厚，呈淡褐色，表面有少许光泽，二倍体种子呈淡黄灰色，表面无光泽(图版4B)。

2.4四倍体甜瓜的品质变化

表5结果显示，四倍体的维生素C与可溶性糖含量都极显著高于二倍体，其中可溶性糖含量超过了二倍体的2倍。这表明。四倍体甜瓜在风味上有所变化，甜度增加：维生素C含量的增加表明营养价值也有所增加。

3讨论与结论

植物体细胞无性系变异是指植物细胞经组织培养产生的遗传变异。体细胞无性系变异是植物组织培养中的普遍现象。难以预料的染色体变异给某些作物的改良带来了机会，也开辟了一条染色体加倍的新途径。

在甜瓜子叶组织培养中，子叶不定芽的分化具有明显的极性现象。这种极性现象主要表现在不定芽的诱导上。靠近胚轴部位的子叶块不定芽的诱导率高于远离胚轴端的子叶块，而且在每个了叶块中也存在这种极性现象，即子叶块的切口中，靠近胚轴的切口容易产生不定芽，远离胚轴的切口则难以形成不定芽。

子叶能否诱导出不定芽有2个关键因素：一是子叶苗龄，二是激素质量浓度。有学者认为，采用未成熟甜瓜子叶进行组织培养时有时间上的优势。马国斌等叫在用不同日龄的甜瓜子叶块作为外植体时观察到丛生芽的诱导率随着子叶日龄的增长而下降，这种现象被认为是由于此时细胞生理上处于“幼态”，全能性细胞多的缘故。

本试验对再生的四倍体及二倍体甜瓜植株进行了茎、叶、花、果实、种子的形态观察，及各项形态指标和主要品质指标的测定。结果表明，除果形指数变小外，四倍体植株茎、叶、花、种子各项形态指标的值均显著大于二倍体，体现出了基因的剂量效应。因此，在对植株进行鉴定时，可以结合四倍体的形态特征及生长缓慢且分枝力差等特点初步筛选变异株，再进一步采用染色体制片技术确定植株倍性，这样可大大节约倍性鉴定时间，减少工作量。本研究还发现，四倍体甜瓜的维生素C、可溶性糖含量也显著高于二倍体，说明二倍体甜瓜经染色体加倍后品质得到了改善，营养价值也有所提高。